目的：探讨桂枝茯苓胶囊对子宫肌瘤大鼠的保护作用及其机制是否与腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-核因子E2相关因子2(Nrf2)通路有关。
方法：选择50只无特定病原体(SPF)级健康雌性未孕SD大鼠为研究对象，由西安交通大学提供，体重180~220g。按照随机数字表法均分为5组:对照组、模型组、桂枝茯苓胶囊低、中、高剂量组，各10只。对照组不建模，前肢腋下皮下注射0.9%氯化钠溶液1mL 30d，再灌胃0.9%氯化钠溶液1mL 42d。模型组、桂枝茯苓胶囊低、中、高剂量组通过前肢腋下皮下注射己烯雌酚0.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹，30d，建立子宫肌瘤模型。模型组再灌胃0.9%氯化钠溶液1mL 42d，桂枝茯苓胶囊低、中、高剂量组分别再灌胃桂枝茯苓胶囊0.8、1.6、3.2 g·kg⁻¹·d⁻¹，42d。观察各组大鼠子宫系数的变化，苏木精和伊红染色观察子宫肌瘤大鼠子宫平滑肌形态，酶联免疫分析测定血清雌二醇和孕酮水平，实时荧光定量PCR检测AMPK、Nrf2、Bcl-2和Bax的mRNA表达情况。
结果：与对照组比较，模型组大鼠的子宫系数、子宫体径均显著增加，血清雌二醇浓度、血清孕酮水平显著升高，模型组大鼠子宫中AMPK、Nrf2、Bcl-2的mRNA表达显著增加，Bax的mRNA表达显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠的子宫系数、子宫体径显著减少，血清雌激素水平显著降低，并改善子宫组织的病理状况，子宫中AMPK、Nrf2、Bcl-2的mRNA表达显著降低，Bax的mRNA表达显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，作用以桂枝茯苓胶囊高剂量组作用最为明显。
结论：桂枝茯苓胶囊对大鼠子宫肌瘤具有明显的抑制作用。其机制可能是通过AMPK-Nrf2通路提高Bax基因表达、下调Bcl-2表达，并减少血浆雌二醇和孕酮来促进子宫肌瘤细胞凋亡。
关键词：大鼠;子宫肌瘤;桂枝茯苓胶囊;核因子E2相关因子2;雌激素
论文《桂枝茯苓胶囊对子宫肌瘤大鼠子宫系数和激素水平的影响相关机制研究》发表在《临床和实验医学杂志》，版权归《临床和实验医学杂志》所有。本文来自网络平台，仅供参考。
正文
子宫平滑肌瘤，又称子宫肌瘤，是妇科临床常见病、多发病之一，占妇科良性肿瘤的90%以上[1]。患者多主诉月经不调，同时可患有不孕不育、继发性贫血等，少数情况下可能发生癌变[2]。现代医学认为子宫肌瘤的主要治疗方法是手术切除，给患者带来了极大的痛苦和济负担[3]。目前，临床急需治疗子宫肌瘤的有效药物。
桂枝茯苓胶囊源于张仲景《金匮要略》中桂枝茯苓丸方,配伍包括桂枝、茯苓、芍药、丹皮、桃仁,可活血化瘀、消癥,现代临床常用治妇科血瘀证[4]。桂枝茯苓胶囊可抑制慢性盆腔炎大鼠炎症水平、促进粘连修复、并提升其免疫功能[5];桂枝茯苓胶囊可通过抑制炎症因子用表达，对原发性痛经大鼠起到治疗作用，该作用主要通过丹皮酚发挥[6];桂枝茯苓胶囊还可通过抑制Fas/Fas信号通路显著改善卵巢早衰大鼠的性激素水平、并减少卵巢细胞凋亡[7]。然而，目前尚不清楚桂枝茯苓胶囊对子宫肌瘤的作用具体机制。
研究表明，富马酸水合酶缺失相关性平滑肌瘤的独特特征之一是激活核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2)靶基因的激活，提示富马酸盐的积累导致癌转录因子Nrf2的激活[8]。然而，Nrf2是否参与了子宫肌瘤的诱发机制尚未完全明确。本实验采用桂枝茯苓胶囊治疗大鼠子宫肌瘤，并探讨其作用机制是否与腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate activated protein kinase, AMPK)-Nrf2有关，可为子宫肌瘤治疗新药的开发和临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
50只无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级健康雌性未孕SD大鼠由西安交通大学提供，许可证号[SYXK(陕)2018-001]，体重180~220g。本研究过程中均按实验动物使用的“3R原则”给予人道主义关怀。实验过程中动物实验相关使用均按照动物伦理相关要求开展。
1.2 试剂与仪器
桂枝茯苓购于江西康缘药业(批号042021);己烯雌酚购自上海医药(集团)有限公司华联制药厂(批号20200605);大鼠血清雌二醇、孕酮酶联免疫吸附试验分析试剂盒购于南京建成生物工程所(批号:20210108;20201202);Trizol试剂、反转录试剂盒、SYBR green荧光预混料购于北京宝日医公司;苏木精和伊红购于北京索莱宝公司;NanoDrop分光光度计购于美国赛默飞公司;聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)仪购于美国伯乐公司。
1.3 子宫肌瘤大鼠模型制备及分组
采用己烯雌酚诱导子宫肌瘤大鼠模型进行研究。按照随机均分为5组，每组各10只。分组情况如下:
• 对照组: 前肢腋下皮下注射0.9%氯化钠溶液1mL 30d，再灌胃0.9%氯化钠溶液1mL 42d。
• 模型组: 前肢腋下皮下注射己烯雌酚(0.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹) 30d，再灌胃0.9%氯化钠溶液1 mL 42d。
• 桂枝茯苓胶囊低剂量组: 前肢腋下皮下注射己烯雌酚(0.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹) 30d，再灌胃桂枝茯苓胶囊(0.8 g·kg⁻¹·d⁻¹) 42d。
• 桂枝茯苓胶囊中剂量组: 前肢腋下皮下注射己烯雌酚(0.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹) 30d，再灌胃桂枝茯苓胶囊(1.6 g·kg⁻¹·d⁻¹) 42d。
• 桂枝茯苓胶囊高剂量组: 前肢腋下皮下注射己烯雌酚(0.2 mg·kg⁻¹·d⁻¹) 30d，再灌胃桂枝茯苓胶囊(3.2 g·kg⁻¹·d⁻¹) 42d。
1.4 观察指标
1.4.1 子宫体径和子宫系数
末次给药后24h处死大鼠，比较子宫系数、子宫颈径和子宫体径。子宫系数=子宫重量除以大鼠体重计算。
1.4.2 苏木精-伊红染色
将大鼠子宫固定于4%多聚甲醛中，于子宫角上方0.5 cm处横切，石蜡包埋，行苏木精-伊红染色，显微镜下观察子宫平滑肌组织中凋亡细胞的形态特征。
1.4.3 大鼠血清雌二醇和孕酮水平检测
处死大鼠前，取尾血，用大鼠血清雌二醇、孕酮酶联免疫吸附试验测定试剂盒，测定各组大鼠血清中雌二醇、孕酮水平，设置3个复孔。
1.4.4 实时荧光定量PCR
用Trizol试剂从大鼠子宫中提取总RNA。用反转录试剂盒合成cDNA。Real-Time PCR采用SYBR green荧光预混料进行。用2⁻ᐧˢᵀ方法将目的基因的相对表达归一化为β-actin。使用的引物序列见表1。
表1 PCR引物序列
基因 上游引物 下游引物
AMPK TTGAAACCCTGAAAATGTCCTGCT GGTGAGCCACAACTTGTTCTT
Nrf2 TCAGCGACGGAAAGAGATGA CCACTGGTTTCTGACTGGATGT
Bax CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG CCAGCCCATGATGGTTCTGAT
Bcl-2 GGTGGGGTCATGTGTGTGG CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC
GAPDH CTGGGCTACACTGAGCACC AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG
1.5 统计学处理
采用 Graphpad Prism 8.0进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x̄±s)表示，多组间比较行单因素方差分析，两组间为t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠的子宫体径和子宫系数情况
与对照组相比，模型组大鼠子宫指数、子宫体径均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，桂枝茯苓胶囊低、中、高剂量组大鼠的子宫系数、子宫体径均显著减小，差异均有统计学意义(P<0.05)，且桂枝茯苓胶囊高剂量组相比桂枝茯苓胶囊低、中剂量组作用更明显。见表2。
表2 各组大鼠的子宫体径和子宫系数情况比较 (x̄±s)
组别 只数 子宫重量(g) 子宫系数(%) 子宫体径(cm)
对照组 10 0.80±0.05 0.40±0.05 0.30±0.06
模型组 10 9.10±0.60ᵃ 4.62±1.20ᵃ 1.71±0.20ᵃ
桂枝茯苓胶囊低剂量组 10 5.60±0.08ᵇ 2.81±0.92ᵇ 0.93±0.10ᵇ
桂枝茯苓胶囊中剂量组 10 5.00±0.70ᵇ 2.52±0.71ᵇ 0.83±0.08ᵇ
桂枝茯苓胶囊高剂量组 10 3.70±0.50ᵇ 1.80±0.50ᵇ 0.78±0.07ᵇ
F值 24.211 9.320 3.290
P值 <0.001 <0.001 <0.001
注：ᵃ与对照组比较，P<0.05;ᵇ与模型组比较，P<0.05。
2.2 各组大鼠子宫病理组织学结果
病理组织学结果显示，子宫肌瘤模型大鼠的子宫肌层未见凋亡细胞，而子宫内膜偶见散在凋亡细胞。与模型组相比，桂枝茯苓胶囊低、中、高剂量组大鼠均可见明显的凋亡细胞，细胞核呈蓝黑色，胞浆呈粉红色，染色质致密、碎裂。见图1。
图1 各组大鼠子宫病理组织学结果(苏木精-伊红染色，×200)
(图示说明：A:对照组;B:模型组;C:桂枝茯苓胶囊低剂量组;D:桂枝茯苓胶囊中剂量组;E:桂枝茯苓胶囊高剂量组)
2.3 各组大鼠血清中雌二醇和孕酮水平
与对照组相比，模型组大鼠血清雌二醇浓度、血清孕酮水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比较，桂枝茯苓胶囊低、中、高剂量组大鼠的血清雌二醇浓度、血清孕酮浓度均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且桂枝茯苓胶囊高剂量组相比桂枝茯苓胶囊低、中剂量组作用更明显。见表3。
表3 各组大鼠血清雌二醇和孕酮水平比较 (x̄±s)
组别 只数 雌二醇(pg/mL) 孕酮(ng/mL)
对照组 10 228.70±18.60 3.20±0.52
模型组 10 833.10±29.70ᵃ 4.29±0.90ᵃ
桂枝茯苓胶囊低剂量组 10 418.60±16.00ᵇ 3.92±0.74ᵇ
桂枝茯苓胶囊中剂量组 10 355.80±17.90ᵇ 3.55±0.56ᵇ
桂枝茯苓胶囊高剂量组 10 270.20±12.50ᵇ 3.33±0.41ᵇ
F值 202.540 16.420
P值 <0.001 <0.001
注：ᵃ与对照组比较，P<0.05;ᵇ与模型组比较，P<0.05。
2.4 各组大鼠子宫AMPK、Nrf2、Bcl-2和Bax的mRNA表达
与对照组相比，模型组大鼠子宫中AMPK、Nrf2、Bcl-2的mRNA表达显著增加，Bax的mRNA表达显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比较，桂枝茯苓胶囊低、中、高剂量组大鼠AMPK、Nrf2和Bcl-2的mRNA表达显著降低，Bax的mRNA表达水平显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，且桂枝茯苓胶囊高剂量组相比桂枝茯苓胶囊低、中剂量组作用更明显。见表4。
表4 各组大鼠子宫AMPK、Nrf2、Bcl-2和Bax的mRNA表达水平比较 (x̄±s)
组别 只数 AMPK Nrf2 Bax Bcl-2
对照组 10 1.01±0.08 2.38±0.71 0.97±0.13 0.83±0.11
模型组 10 3.12±0.48ᵃ 5.29±1.93ᵃ 0.59±0.08ᵃ 2.57±0.46ᵃ
桂枝茯苓胶囊低剂量组 10 2.96±0.43 4.53±1.22ᵇ 0.62±0.11 2.08±0.33ᵇ
桂枝茯苓胶囊中剂量组 10 2.58±0.32ᵇ 3.66±1.18ᵇ 0.75±0.10ᵇ 1.71±0.32ᵇ
桂枝茯苓胶囊高剂量组 10 2.01±0.30ᵇ 2.78±0.98ᵇ 0.88±0.09ᵇ 1.43±0.38ᵇ
F值 12.590 18.436 6.247 9.924
P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001
注：ᵃ与对照组比较，P<0.05;ᵇ与模型组比较，P<0.05。
3 讨论
子宫肌瘤是育龄妇女中最常见的良性肿瘤，调查显示到50岁时几乎80%~90%的妇女均能发现肌瘤[1]。子宫肌瘤可引起疼痛、月经过多或不孕。子宫肌瘤的发展随年龄增长而增加。随着社会的发展，试图受孕女性的年龄不断增加，因此对子宫肌瘤的微创和保留子宫手术治疗的需求不断增长。过去几十年来，用于治疗子宫肌瘤的外科手术技术的主要重点是将肿瘤摘除并闭合子宫切口，可通过使用超声波或射频来破坏子宫肌瘤而无需切开子宫壁[9]。然而，没有子宫瘢痕，这将在妊娠期间带来破裂的风险。因此，目前临床急需治疗子宫肌瘤的有效药物。
子宫肌瘤发病机制复杂，涉及体内部分或全部雌激素、孕酮及其受体的变化，局部多肽生长因子的变化等，其中对卵巢激素依赖性的研究已达成共识[10]。研究表明，雌激素和黄体酮可增加子宫动脉的活力，而子宫肌瘤局部雌激素水平升高可诱导一氧化氮合酶活性，从而引起子宫血管扩张，增加血流量，改善子宫肌瘤的血供，促进肿瘤生长[11-12]。本研究采用外源性雌激素和孕酮联合方案建立子宫肌瘤模型。灌胃给予桂枝茯苓胶囊后，子宫肌瘤大鼠子宫系数降低，血清雌二醇、孕酮水平降低，子宫平滑肌增生等病理形态学改变明显改善，提示桂枝茯苓胶囊具有一定的抗子宫肌瘤作用。
新近研究表明，细胞内富马酸盐的高度积累可直接改变各种细胞信号传导途径，包括:缺氧诱导因子1α活性增加，Nrf2活性增加和细胞铁稳态降低[13]。其中，富马酸盐的累积导致Nrf2激活，而抑制谷氨酰胺酶则可以选择性地杀死具有持续Nrf2活化作用的子宫平滑肌瘤细胞[14]。本研究中发现，子宫肌瘤大鼠子宫中AMPK、Nrf2基因的表达显著增加，给予子宫肌瘤大鼠灌胃桂枝茯苓胶囊治疗42d可显著降低其AMPK、Nrf2基因的表达。
在子宫肌瘤的进展中，凋亡基因Bax表达降低，Bcl-2表达升高，细胞凋亡程序不能有效启动，导致子宫肌细胞凋亡阻滞和细胞凋亡紊乱，阻碍异常细胞的及时更新和清除，最终抑制子宫肌细胞凋亡。子宫肌细胞不能通过凋亡途径进行更新，子宫肌细胞可发生处于无限或过度增殖状态，从而导致子宫肌瘤的发生。本研究发现凋亡基因Bax在大鼠子宫肌瘤组织中的表达显著低于对照组子宫肌肉组织，提示Bax在子宫肌瘤组织中处于低表达或下调状态;而子宫肌瘤组织中凋亡基因Bcl-2的表达显著高于对照组，提示凋亡基因Bcl-2在子宫肌瘤组织中处于高表达或上调状态。当分别给予子宫肌瘤大鼠灌胃桂枝茯苓胶囊处理42d后，可显著降低Bcl-2表达、增加Bax表达水平，从而抑制子宫肌瘤的发生。以上结果提示，子宫肌瘤大鼠子宫中AMPK-Nrf2信号的过度激活，导致凋亡基因Bax表达降低，Bcl-2表达升高可能是其机制之一，桂枝茯苓胶囊治疗可通过抑制子宫肌瘤大鼠子宫中 AMPK-Nrf2信号通路，进而降低Bcl-2、增加Bax表达对子宫肌瘤发挥保护作用。
尽管如此，本研究仍存在一定局限性。例如，本实验未检测桂枝茯苓胶囊对于实验大鼠的长期毒性。因此，桂枝茯苓胶囊作为子宫肌瘤治疗药物的安全性尚有待进一步研究证实。
4 结论
综上所述，本研究表明，子宫肌瘤大鼠子宫中AMPK-Nrf2信号过度激活，导致了其凋亡基因Bax表达降低，Bcl-2表达升高是子宫肌瘤的发病机制之一。桂枝茯苓胶囊对子宫肌瘤的治疗作用可能是通过抑制子宫肌瘤大鼠子宫中AMPK-Nrf2信号通路，下调Bcl-2、上调Bax表达，从而促进子宫肌瘤细胞凋亡而实现对子宫肌瘤的保护作用。提示了桂枝茯苓胶囊可能作为保护和治疗子宫肌瘤的候选药物具有一定研发价值。
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