摘要：利用报告基因β-半乳糖苷酶，分析了枯草杆菌启动子43及amy的转录活性。结果表明，在基本培养基条件下，启动子43在对数前期开始表现转录活性，随菌量增大活性迅速提高，稳定期逐步平稳;在富营养培养基条件下，启动子43转录活性在对数前期与基本培养基条件下相似，在对数期转录活性增加速率则高于基本培养基条件下的增加速率;启动子43转录活性在E coli和B subtilis体内基本一致。启动子amy在淀粉诱导下转录活性较高，在添加葡萄糖以及无诱导条件下酶活较低。
关键词：枯草杆菌;启动子;转录活性;基因表达
启动子是实现外源基因高效表达的关键，是表达载体的核心成分，启动子的转录活性分析是表达载体构建工作的重点之一。在枯草杆菌中常见启动子重叠和串连现象，例如RNA聚合酶σ43(σA)和σ37(σB)的识别区在胞嘧啶脱氨酶基因启动子43序列内重叠[2]。σ43负责营养期的基因起始转录，而σ37负责对数晚期和平台期早期的基因起始转录，因而启动子43可在多个时期起始转录，是理想的发酵工程启动子[3- 4]。本研究应用报告基因β-半乳糖苷酶基因(bgaB)，分析启动子43及枯草杆菌α-淀粉酶基因启动子amy的转录活性，为进一步开发高效表达系统奠定基础。
材料和方法
材料
[2]菌株B subtilis A747和E coli DH5α购自中国典型培养物保藏中心;质粒pEB-bgaB为笔者所在实验室构建，该质粒为大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体，携带β-半乳糖苷酶基因(bgaB)。限制性核酸内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自romage公司，Taq DNA聚合酶和LA Taq DNA聚合酶购自宝生物公司，质粒提取、DNA回收试剂盒购自杭州维特洁公司。
2方法
2引物设计根据NCBI数据库中B subtilis基因组上的43和amy序列设计引物，43片段扩增后保留其原有起始密码子(ATG)，上下游引物分别为5′-[ZZ(Z]CCGGATCC[ZZ)]TTGTAGAGCTCAGCAT-3′(下划线为BamHⅠ酶切位点)和5′-GG[ZZ(Z]CTGCAG[ZZ)]CATGTGTACATTCCTC-3′(下划线为stⅠ酶切位点);amy片段扩增后保留了原有信号肽序列，上下游引物分别为5′-AA[ZZ(Z]GGATCC[ZZ)]GCTCATGCCGAGAATAGAC-3′(下划线为BamHⅠ酶切位点)和5′-AT[ZZ(Z]CTGCAG[ZZ)]TTCAGCACTCGCAGCCG-3′(下划线为stⅠ酶切位点)。CR扩增条件：92 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环30次。
22[2]载体构建在载体pEB-bgaB上bgaB 5′端的BamHⅠ[2]和stⅠ酶切位点之间，分别插入经回收并酶切的CR产物43和amy，获得质粒pEB-43-bgaB和pEB-amy-bgaB;载体构建成功后，启动子片段43和amy可起始转录bgaB。载体电转入E coli DH5α后，将感受态细胞涂布在含X-gal平板，挑选8 h内出现明显蓝色菌落，提取质粒，酶切鉴定。挑取单菌落摇菌，测定整个生长时期β-半乳糖苷酶活性。
23β-半乳糖苷酶活性测定方法和定义[5]将一定体积菌液离心收集菌体，重悬于700 μL Z-buffer(006 mol/L Na2HO4·7H2O，004 mol/L NaH2O4，00 mol/L KCl，000 mol/L MgSO4·7 H2O和005 mol/L β-巯基乙醇，pH值70)，加入0 μL Triton X 00(0%)和溶菌酶0 μL[3](0 g/L)，静止30 min后加入邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONG)200 μL(4 g/L)，混匀后置于55 ℃水浴5 min，加入[4]Na2CO3 500 μL( mol/L)终止反应，离心，取上清并测量其D420 nm。
酶活性(U)=[SX(]D420 nm× 000D595 nm×5(min)×V[SX)](D595 nm为测前菌液吸光度;V为所用菌液的体积，mL)。
2结果与分析
CR扩增获得的43片段大小在250～500 bp之间，amy片段大小在500～750 bp之间(图)，与预计大小相符。
在基本培养基(胰蛋白胨%，酵母提取物05%，氯化钠%)条件下，E coli DH5α(pEB-43-bgaB)合成的β-半乳糖苷酶活性在对数前期开始表现，随着菌量增大活性迅速提高，稳定期后逐步平稳，最高可达6 650 U，稳定期后随菌群衰退酶活下降(图2)。在富营养培养基(胰蛋白胨2%，酵母提取物%，氯化钠%)条件下，E coli DH5α(pEB-43-bgaB)[CM(233]合成的 β-半乳糖苷酶活性在对数前期与基本培养基[CM)]
[FK(W2][TZTTtif][FK)]
的结果相似，进入稳定期酶活性增加速率则逐渐超过在基本培养基中速率，最高为9 200 U(图2)。
[FK(W0][TZTT2tif][FK)]
B subtils(pEB-43-bgaB)在富营养培养基条件下，β-半乳糖苷酶活性与E coli DH5α(pEB-amy-bgaB)在在富营养培养基条件下相似，对数前期开始表现，随着菌量增长活性迅速提高，稳定期后逐步平稳，最高可达9 550 U，在稳定期后随着菌群衰退酶活性下降(图3)。
[FK(W0][TZTT3tif][FK)]
E coli DH5α(pEB-amy-bgaB)在添加%可溶性淀粉诱导条件下，β-半乳糖苷酶活性可达 000 U;而在添加%葡萄糖以及无诱导条件下酶活很低，最高只有30 U。B subtils(pEB-amy-bgaB)在无诱导条件下β-半乳糖苷酶活性略高(750 U)。
3讨论
本研究通过检测β-半乳糖苷酶活性，研究了启动子43及amy在B subtils和E coli中的转录活性。本研究发现43转录合成的β-半乳糖苷酶活性，在(pEB-43-bgaB)和(pEB-43-bgaB)中的结果相似，对数前期开始表现，随着菌量增长活性迅速提高，稳定期逐步平稳，同样在稳定期后随着菌群衰退，酶活性下降。在B subtils(pEB-43-bgaB)中β-半乳糖苷酶活性可达9 500 U以上。本研究结果与Ye等在质粒pUB0基础上，以枯草杆菌WB700为宿主菌，利用43启动子和果聚糖蔗糖酶信号肽，在普通培养条件下分泌表达葡萄球菌激酶的结果基本一致[6]。启动子43在E coli中，β-半乳糖苷酶转录的水平可达9 200 U，这可能是由于E coli RNA聚合酶σ70与B subtils σ43具有同源性[6-0]，能够识别结合启动子43，使之在E coli中同样能转录。因而可利用启动子43先在E coli中表达检测外源基因，再转入B subtils中表达。
序列分析比对发现43序列与σ43和σ37的识别序列并不完全保守，σ43和σ37识别序列的保守性显然与启动子的高活性不相符。因而Wang等推测在σ43和σ37识别序列之外还存在其他能够影响启动子活性的因素[8]。在本实验室，另一研究将启动子43的核糖体结合序列删除后，替换上原核典型的核糖体结合序列，发现其转录效率仍然较高，说明影响因素可能不是核糖体结合序列。
本研究发现不同营养条件可影响启动子43的转录活性。对数前期，在基本培养基和富营养条件下启动子43的转录活性差异不大;进入稳定期后，出现差距，43在基本培养基转录表达的β-半乳糖苷酶活性增长逐渐进入了平稳期，而富营养条件下其活性增长率依然很高，持续向上增长。这种差异可能由于启动子43转录效率较高与合成mRNA及蛋白质原料有限之间的矛盾引起。对数前期及对数期，菌量小，营养充足，差异不明显，进入稳定期后，随着菌群扩大及启动子43高效率转录，营养矛盾造成的差异逐步突出，因而优化营养条件有助于提高启动子43的转录活性。
启动子amy在E coli中转录活性较低，β-半乳糖苷酶活性在诱导条件下最高为 000 U。活性弱的原因可能是虽然启动子amy也是由B subtils RNA聚合酶σ43识别转录，但对E coli的σ70因子亲和性低，因而在E coli中转录水平低;另一原因也可能是携带α-淀粉酶的信号肽的β-半乳糖苷酶融合元，在E coli胞内未能切除信号肽，以无活性的蛋白形式存在。启动子amy在B subtils中转录活性本身可能就不太高，Gat以绿色荧光蛋白为报告基因，利用B subtils WB600和pUB0衍生载体，发现amy活性较低。因此amy的序列还有待改造提高其活性。
参考文献：
[1]徐友强，马翠卿，陶飞，等 细菌启动子识别及应用研究进展 生物工程学报，200，26(0)：393-403
[2]Wang Z，Doi R H Overlapping promoters transcribed by Bacillus subtilis sigma 55 and sigma 37 RNA polymerase holoenzymes during growth and stationary phases ournal of Biological Chemistry，984，259(3)：869-8625
转载请注明来自：http://www.lunwencheng.com/lunwen/nye/7747.html
