摘要: 目的 探讨雌激素受体( estrogen receptor β，ERβ) 对膀胱癌细胞生物活性及丝裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信号通路的影响。 方法 选取 30 例在我院治疗的膀胱癌患者的手术病例标本作为检测样本，同时选取距肿瘤边缘 2 cm 处的癌旁组织标本做比较，使用免疫组化( IHC) 方法检测两类样本中的 ERβ 含量。将膀胱癌细胞 BIU-87 分为膀胱癌组( 无转染 BIU-87 细胞) 、ERβ-NC 组( 转染 ERβ 空载体) 、ERβ-siRNA 组( 转染 ERβ siRNA) 。采用 MTT 检测细胞增殖，Hoechst33258 荧光染色检测细胞凋亡，Transwell 小室检测细胞侵袭，细胞划痕检测细胞迁移，RT-PCR 和 Western blot 分别检测 ERβ 及 P38 MAPK 表达。 结果 与癌旁组织比较，膀胱癌组织中 ERβ 阳性表达明显升高( P < 0. 05) 。与膀胱癌组和 ERβ-NC 组相比，ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞活力降低，细胞凋亡率升高，细胞侵袭、迁移数量减少( 均 P < 0. 05) ，膀胱癌细胞中 ERβ 及 P38 MAPK mRNA、p-P38 MAPK 及 ERK1 /2 蛋白表达量降低( 均 P < 0. 05) 。膀胱癌组与 ERβ-NC 组比较上述指标无显著差异( P > 0. 05) 。 结论 下调 ERβ 的表达对抑制膀胱癌细胞迁移、侵袭等生物活性发挥积极作用，分析原因可能与靶向调控 P38 MAPK、ERK1 /2 表达相关。
关键词: 膀胱癌; 复发; 迁移; MAPK 信号通路
膀胱癌是起源于膀胱黏膜上的一种泌尿系恶性病变。近些年膀胱癌患者发病数量逐渐增多，对人类的健康发展极为不利[1]。膀胱癌早期病症较为隐匿，缺乏特异性，患者通常无明显症状，往往容易被忽视。伴随着病情的发展，患者机体发生间断性血尿、病灶处刺激等症状时才逐渐引起注意，但此时大多患者病情已经处于较为严重阶段，预后效果不理想[2]。有研究表示早期确诊并积极配合治疗的 膀胱癌患者的预后更佳[3，4]。研究发现雌激素受体 ( strogen receptor，ER) 可能是引起膀胱癌发生概率更高的重要因素之一[5]。ER 来自核受体超家族，是由配体激活的转录因子。有报道显示 ER 信号途径在多种类型的恶性肿瘤疾病的发生、发展中发挥重要作用，这受到广大学者的关注[6]。其亚型之一的 ERβ 在膀胱癌组织中的表达上调且与膀胱癌的病理分级以及患者生存期密切相关，可作为该病的预后指标之一[7]。但目前有研究表明抑制 ERβ 表达对膀胱癌细胞的增殖、迁移等过程发挥抑制作用，但其作用机制尚不明确。因此本研究中我们通过降低 ERβ 在膀胱癌细胞中的表达水平探讨其对膀胱癌细胞生物活性的影响机制，以期为膀胱癌的诊疗开辟出新的途径。
1 材料和方法
1. 1 一般资料
选取 2018 年 2 月至 2019 年 8 月于我院治疗的 30 例膀胱癌患者的手术病例标本以及癌旁 2 cm 的组织作为研究样本，样本经石蜡包埋，存于 - 80 ℃ 液氮，且经过本院伦理委员会本次研究审核批准。 BIU-87 细胞购买自青岛奥科生物开发有限公司。
1. 2 纳入标准
①已确诊为膀胱癌; ②患者及家属对本次研究知情同意; ③首次接受膀胱癌手术治疗。
1. 3 排除标准
①经过放化疗冶疗的患者; ②患者资料不完整; ③患者拒绝配合相关研究等。
1. 4 实验仪器与试剂
免疫组化 SP 试剂盒( 上海沪震生物科技有限公司) ; RT-PCR 试剂盒( 上海谷研) ; ERβ 及阴性对照 siRNA( 浙江百奥迈科) ; 流式细胞仪( 江苏海博生物) ; 电泳仪、PCR 仪( 北京由莱普特科学仪器) ; PVDF 膜( 北京环宇金鹰) ; 恒温摇床( 上海沉汇仪器 Co. ，Ltd) 等。胎牛血清( 滁州仕诺达生物科技) ; P38 MAPK、p-P38 MAPK 抗体购自上海雷浩信息科技) ; 二甲基亚砜( DMSO) 购自金克隆( 北京) 生物技术; Transwell 小室购自北京明阳科华生物科技。
1. 5 细胞培养及处理
1. 5. 1 细胞培养 在 DMEM 培育液( 有胎牛血清) 中培养 BIU-87 细胞株。细胞数到 80% - 90% 时进行胰蛋白酶消化，然后采取 1 600 r /min 离心 5 min，收集、重悬并培养细胞。
1. 5. 2 分组 将膀胱癌细胞分为膀胱癌组( 无转染 BIU-87 细胞) 、ERβ-NC 组( 转染 ERβ 空载体) 、 ERβ-siRNA 组( 转染 ERβ siRNA) 。
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1. 5. 3 细胞转染 将数量为 1 × 104 个的 BIU-87 细胞株接种到 96 孔中，15 h 后，待 BIU-87 细胞重复融合，在 EP 管中放入 200 μl 转染液体( Lipofectamine 2000 转染试剂) 和 4 μl 脂质体，然后分别加入 5 μg 的 ERβ siRNA 和 5 μg ERβ 空载体，充分混合后，转染 9 h 后，用含血清双抗的培养液继续培养。
1. 6 实验方法
1. 6. 1 细胞免疫组化检测 ERβ 在膀胱癌组织及其癌旁组织中的表达 采用 SP 法，步骤参照说明书。取样本脱蜡水化，H2O2 失活，低火加热 1 min 修复抗原 加 血 清 封 闭，加 一 抗 P38 MAPK 及 ERK1 /2 ( 1 ∶ 1 000) ，PBS 冲洗，再加入 IgG( 1 ∶ 2 000) ，最后加入 DAB 显色剂染色。染色时，以 PBS 代替一抗。显微镜观察结果。膀胱癌组织中的阳性信号为淡黄色至棕褐色，位于细胞核。计分采用 4 级记分评价方法，标准如下: 无染色，分值 A 为 0 分，染色细胞占比为 0 - 5%，分值 B 为 0 分; 浅黄色染色，分值 A 为 1 分，染色细胞占比为 6% - 25%，分值 B 为 1 分; 棕黄色染色，分值 A 为 2 分，染色细胞占比为 26% - 49%，分值 B 为 2 分; 棕色染色，分值 A 为 3 分，染色细胞占比为 50% - 100%，分值 B 为 3 分。分值 A 与 B 之和为 0 分或者 1 分表示细胞为阴性，A 与 B 之和为≥2 分为阳性。
1. 6. 2 RT-PCR 检测 ERβ、P38 MAPK mRNA 表达把保存在 - 80 ℃环境中的 BIU-87 细胞取出研磨，用 Trizol 进行总 RNA 的提取，逆转录参照说明书执行，将逆转后所得的 cDNA 进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，内参采用 GAPDH，变性 95 ℃ 3 min 变性 95 ℃ 5 s 退火 60 ℃ 1 min 共 40 个循环。取平均值计算 Ct 值，计算方法用 2 - ΔΔCt 法。序列见表 1。
1. 6. 3 MTT 细 胞 活 力 检 测 细 胞 数 量、接 种 同 1. 5. 1 细胞培养方法，然后将细胞置于 5% CO2、37 ℃ 培养 12 h，转染 24 h，然后换液( 此时即为 0 h) 。继续培养 0 - 96 h，每 24 h 记录，吸弃培养液，加新培养液100 μl和5 mg /ml的MTT溶液20 μl，孵育4 h，吸弃培养液，每孔加入 150 μl DMSO，振荡孵育 10 min。酶联免疫检测仪 492 nm 测定光吸收值。
1. 6. 4 Hoechst33258 荧光染色法检测细胞凋亡膀胱癌组、ERβ-NC 组和 ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞接种、数量同 1. 5. 1 细胞培养方法后，采用 40 g /L 的多聚甲醛固定 0. 5 h，采用 TrintonX-100 透明处理，加入 Hoechst 荧光材料染色，常温下 0. 5 h 后，检测细胞凋亡( SW480 细胞核固缩，呈现碎片状) ，凋亡率 = 凋亡细胞/细胞总数 × 100%。
1. 6. 5 Transwell 小室检测细胞侵袭能力 膀胱癌组、ERβ-NC 组和 ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞接种、数量同 1. 5. 1，将 50 mg /L 的基质胶稀释后加入小室上层，37 ℃下呈凝胶状态，细胞数目为 1 × 105 /ml，上室中加入细胞悬液，下室中加入少量胎牛血清培养基，37. 5 ℃，培养 2 d，取出培养基，拭去残留细胞，现配结晶紫，每孔 500 μl，将小室放入，25 ℃ 染色 30 min，PBS 清洗 1 次，稍晾干。显微镜观察每个样本连续选 5 清晰视野进行数量统计，然后计算器平均数。
1. 6. 6 Transwell 实验检测膀胱癌 BIU-87 细胞迁移膀胱癌组、ERβ-NC 组和 ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞放于 6 孔板内，细胞充分生长长满底部时，每隔 0. 5 cm 利用 Mark 画一条垂直线，穿过孔，PBS 清洗 3 次，加入培养基 24 h 取样，显微镜拍照，用 Leica 图形分析系统测量植块边缘至迁移出膀胱癌细胞的最远相对距离，用显微测量尺校正并计算迁移的最远距离。
1. 6. 7 Westernblot 检测蛋白表达 将 BIU-87 细胞进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在 - 20 ℃ 的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混匀，按照 4 ∶ 1 的比例进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。50 μg 蛋白样品电泳后转移到 PVDF 膜上，加脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗 P38 MAPK 及 ERK1 /2 ( 1 ∶ 1 000) 后 TTBS3 次漂洗( 间隔 10 min) ，最后加入 IgG( 1 ∶ 2 000) 对溶液稀释，25 ℃ 封闭 1 h。取出 PVDF 膜 TTBS 漂洗 3 次( 间隔 10 min) ，DAB 显色后照相。
1. 7 统计学分析
采用 SPSS23. 0 软件分析膀胱癌组、ERβ-NC 组、ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞侵袭、凋亡等数据，多组比较采用单因素方差分析，多个时间点比较重复测量方差分析，事后检验采用 Bonferroni 法进行组间两两比较，以 P < 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 免疫组化法检测 ERβ 在膀胱癌组织和癌旁组织阳性表达率
结果显示 ERβ 阳性细胞呈淡黄色或棕黄色颗粒，位于细胞核中( 见图 1) ，ERβ 在膀胱癌组织中的阳 性 率 为 46. 67%，在癌旁组织中阳性率为 6. 67%，差异有统计学意义( P < 0. 05，见表 2) 。
2. 2 RT-PCR 检测 BIU-87 细胞中 ERβ、P38 MAPK mRNA 相对表达量
三组比较，ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞中 ERβ 的表达量最低( 见图 2) ，提示转染成功。ERβ-siRNA 组 ERβ 及 P38 MAPK mRNA 表达量低于其他两组( P < 0. 01) ，膀胱癌组和 ERβ-NC 组 ERβ 及 P38 MAPK mRNA 相对表达量相似，差异无统计学意义 ( P > 0. 05，见图 2) 。
2. 3 MTT 检测膀胱癌组、ERβ-NC 组、ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞活力
结果显示，BIU-87 细胞活力呈时间依赖性增加，培养 24 h 时，三组间 BIU-87 细胞活力无统计学差异( P > 0. 05) ，培养 48，72，96 h 时，ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞活力较膀胱癌组和 ERβ-NC 组比较明显减弱( P < 0. 05) ，膀胱癌组 BIU-87 细胞活力与 ERβ-NC 组比较差异无统计学意义( P > 0. 05，见图3) 。
2. 4 Hoechst33258 荧光染色检测膀胱癌细胞凋亡
结果显示 ERβ-siRNA 组与膀胱癌组、ERβ-NC组比较 BIU-87 细胞凋亡数量最多( P < 0. 05) ; 膀胱癌组 BIU-87 细胞荧光强度最弱，细胞凋亡率最低，膀胱癌组与 ERβ-NC 组比较差异无统计学意义( P > 0. 05，见图 4，5) 。
2. 5 Transwell 小室检测 BIU-87 细胞侵袭情况
膀胱癌组、ERβ-NC 组和 ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞侵 袭 数 量 比 较 有 显 著 差 异 ( F = 1857，P < 0. 001) ，其中 ERβ-siRNA 组侵袭数量明显少于其他两组( 均 P < 0. 05) ，ERβ-NC 组细胞侵袭数量与膀胱癌组相比差异无统计学意义( P > 0. 05，见图6，7) 。
2. 6 细胞划痕实验检测细胞迁移
培养 0 h 时，各组 BIU-87 细胞无迁移; 培养 24 h 时，ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞迁移距离与 ERβ-NC 组及膀胱癌组比较明显增加( 均 P < 0. 05) ，ERβ-NC 组 BIU-87 细胞迁移距离与膀胱癌组比较差异无统计学意义( P > 0. 05，见图 8，9) 。
2. 7 Westernblot 法检测细胞中蛋白相对表达量
ERβ-siRNA 组 BIU-87 细胞中 P38 MAPK、p-P38 MAPK 及 ERK1 /2 蛋白表达与膀胱癌组、ERβ-NC 组比较明显降低( P < 0. 01) ，膀胱癌组 P38 MAPK、pP38 MAPK及ERK1 /2蛋白表达量与ERβ-NC组比较差异无统计学意义( P > 0. 05，见图 10) 。
3 讨论
目前在膀胱癌的治疗中主要依靠手术切除配合化疗来缓解患者的病痛，但是该治疗方式被证实也存在局限性，多类并发症的发生以及手术对医生经验技术的依赖都给手术结果造成了不确定性[8]。近些年大量研究证实雌激素受体能够通过 ERβ 调节尿路上皮癌细胞的生长参与膀胱癌的发生发展进程，因此有学者推测可将 ERβ 作为膀胱癌治疗的重要靶点，该发现为该病的治疗提供了新的方向[9]。 ERβ 定位于染色体 14q22 - 24，近些年关于其与各类肿瘤疾病的研究较为常见，但其在肿瘤疾病中的机制尚未完全阐明[10]。因此在本研究中我们通过抑制物转染膀胱癌细胞并进行实验检测，观察 ERβ 对膀胱癌细胞株侵袭、增殖等生物活性的影响。
在既往研究中关于雄性激素受体与膀胱癌关系的研究较为常见，大量报道证实雄性激素参与膀胱癌的发生、发展并在其中发挥重要作用[11]。ERβ是 ER 的亚型之一，主要分布于卵巢、甲状腺、膀胱等组织中，近些年其在膀胱癌的发展研究中受到关注。舒筠然等[12]学者在研究中表示 ERβ 在膀胱癌中过表达与膀胱癌的严重程度正相关，在膀胱癌的发生过程中发挥主导作用，其机制可能与调控 P2RY2e 的表达相关。有研究表明[13]，ERβ 可作为评估非肌肉浸润型膀胱癌预后的指标，可抑制钙黏蛋白转换，并可能成为膀胱癌治疗的潜在靶点。以上研究结果皆提示 ERβ 在膀胱癌细胞中表达失调。本研究中我们采用免疫组法检测发现 ERβ 在膀胱癌组织中的表达较癌旁组织明显提升，本文通过对膀胱癌细胞株转染抑制物 ERβ-siRNA，结果显示转染 ERβsiRNA 的细胞活性降低，细胞的迁移、侵袭能力较其他两组明显弱化，细胞的凋亡数量升高，提示减少 ERβ 的表达能够降低膀胱癌细胞的生物活性，促进癌细胞凋亡。丁梦婷[14]研究结果指出，肥大细胞的增加对膀胱癌细胞的侵袭发挥促进作用，加速了膀胱癌患者不良结局的发生概率，其机制与 ERβ 的活化相关，且实验中采用 ERβ 拮抗剂降低 ERβ 在膀胱癌细胞中的表达，结果发现肥大细胞对膀胱癌细胞活性的促进作用得到有效逆转，为膀胱癌的治疗提供了新的靶标，这与本文研究结果相似。有学者的研究[15]显示，miR-451 能够通过增加 E-cadherin 的表达抑制膀胱癌细胞的侵袭、增殖等生物进程。姚佳沛等[16]在研究中收集了 60 例膀胱癌根治手术患者的病理组织进行检测发现 ERβ 在膀胱癌组织中的表达升高。
MAPK 信号通路一旦被激活进入细胞核内可以调控重要的细胞活动，其磷酸化后激活转录分子调节基因表达，在细胞的迁移、凋亡等过程中具有重要作用。p-P38 MAPK、ERK1 /2 是 MAPK 的重要组成部分，有 文 献 表 明 ERK1 及 MAPK 磷 酸 化 p-P38 MAPK 信号通路参与肿瘤的发生发展，其信号通路被活化后可提高肿瘤细胞的生物活性[17]。于洋等[18]研究发 现，敲 除 ERβ 表达可降低前列腺癌 PC3 细胞增殖、侵袭，其作用机制与抑制 ERK1 /2 信号通路有关。潘国凤等[19]通过体外细胞实验建立乳腺癌大鼠模型，结果表明雌激素受体可通过抑制 p38-MAPK 及 ERK 磷酸化水平来降低肿瘤增殖，提高其凋亡率。国外研究表明雌激素受体可诱导肿瘤的发 生 发 展，通 过 诱 导 17β - 雌 二 醇 调 节 p38 / MAPK 水平，从而改善结肠癌肿瘤[20]。
综上所述，下调 ERβ 的表达对抑制膀胱癌细胞迁移、侵袭等生物活性发挥积极作用，分析原因可能与靶向调控 p-P38 MAPK 及 ERK1 /2 信号相关。本实验在研究的过程中有一定的不足，由于成本等问题，本文仅对我院收集的 30 例患者膀胱癌样本进行实验，样本量较小，不能排除细胞种类对实验所带来的影响。另外，本组实验只采用 ERβ 抑制物进行试验，具有局限性，在今后的研究中应加入更多的实验方法为膀胱癌诊疗方案的研究贡献更有利的科学依据。——论文作者：于汝通* ，王 磊，孙国良，蒋 泉，李 洋
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