摘要:为了建立同时测定羊奶中5种阿维菌素类药物(avermectins，AVMs)，包括阿维菌素(AVM)、伊维菌素(IVM)、多拉菌素(DOR)、埃玛菌素(EMM)、埃普利诺菌素(EPR)残留量的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法，试验采用乙腈提取羊奶样品中的AVMs，提取液用C18固相萃取柱净化后经C18色谱柱分离，采用电喷雾离子源正离子(ESI+)在多反应离子监测(MRM)模式下同时测定5种AVMs，并用基质标准曲线回归方程定量，考察所建立方法的准确度和精密度，评价5种AVMs在6批不同来源羊奶中的基质效应，同时应用建立的方法检测10批鲜羊奶样品中5种AVMs。结果表明:IVM和EMM在0.5～50μg/L范围内以及AVM、DOM和EPR在2～200μg/L范围内线性关系良好，相关系数均达到0.9996以上;方法的检出限为0.2～1.0μg/kg，定量下限为0.5～2.0μg/kg。羊奶基质中IVM和EMM在0.5，2，5μg/kg加标水平以及AVM、DOM和EPR在2，8，20μg/kg加标水平下，5种AVMs的回收率在73.5%～108.0%范围内，批内和批间相对标准偏差均小于15.0%。5种AVMs的基质效应均控制在85.0%～115.0%之间，基质效应差异不明显。试验建立的超高效液相-串联质谱法对10批鲜羊奶样品的检测结果与秦皇岛出入境检验检疫局的检测结果一致，仅从1份样品中检出IVM残留量为13.4μg/kg，其他样品均未检出AVMs残留。说明试验建立的方法简单、稳定、可靠，可用于羊奶中AVMs残留的检测。
关键词:超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS);阿维菌素类药物(AVMs);羊奶;固相萃取;残留;多反应监测(MRM)
阿维菌素类药物(avermectins，AVMs)是从链霉菌的发酵菌丝中提取分离的一组新型、广谱、高效、安全的大环内酯类抗生素，包括阿维菌素(AVM)、伊维菌素(IVM)、莫西菌素(MOX)、多拉菌素(DOR)、埃玛菌素(EMM)、埃普利诺菌素(EPR)和塞拉菌素(SEL)等。AVMs对动物体内外寄生的线虫、节肢动物以及农作物上的害虫、螨类有极强的驱杀作用，可使抗蠕虫药物用药剂量由mg/kg级下降到μg/kg级，该药物在国内外农牧业生产中使用广泛[1-3]。但AVMs作为脂溶性药物，在动物体内的残留时间较长，因此世界卫生组织将其列为高毒化合物[4]。联合国食品法典委员会(CAC)、欧盟(EU)和中国均制定了AVMs的最高残留限量(MRLs)。CAC规定，牛奶中IVM、DOR和EPR的MRLs分别为10μg/kg、15μg/kg和20μg/kg;EC规定，牛奶中EPR和MOX的MRLs分别为20μg/kg和40μg/kg，AVM、IVM及DOR禁用于产奶牛[5];我国农业农村部规定，牛奶中IVM和DOR的MRLs分别为10μg/kg和15μg/kg，AVM禁用于产奶牛和羊[6]。AVMs已成为食品中农兽药残留重点监控对象之一。
目前，畜产品中AVMs残留的检测方法主要有酶联免疫吸附(ELISA)法、液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法、液相色谱-串联质谱检测(LC-MS/MS)法，其中ELISA法虽然简单、快速，又不需要昂贵的仪器设备，但多种AVMs间存在交叉反应[7]，无法准确定性定量;HPLC-FLD法是使用最广泛的检测AVMs的方法，但由于AVMs自身没有对称的共轭结构，只能经荧光衍生化后生成具有对称共轭苯环结构才能发荧光[8]，前处理复杂、耗时，且多种AVMs很难分离;LC-MS/MS法以其高灵敏度、低检测限、样本用量少、高通量、检测速度快的优势被广泛用于药物残留检测，而且测定多种AVMs时不需要衍生化处理。
本试验利用超高效液相串联质谱的高速、高选择性、高分离度和高灵敏度的特性，建立同时测定羊奶中AVM、IVM、DOR、EMM和EPR5种AVMs残留的检测方法，即超高效液相色谱-串联质谱(ultra-highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry，UPLC-MS/MS)法，该方法简单、操作性强，能够对羊奶中多种AVMs的残留进行准确定性、定量检测，现将该方法对羊奶中5种AVMs残留的检测结果报道如下。
1材料
1.1样品
空白羊奶，来源于秦皇岛市卢龙县未使用过AVMs药物的某奶羊场;基质效应评价羊奶(A、B、C、D、E、F)，来源于秦皇岛地区、承德地区和张家口地区奶羊场，并经秦皇岛出入境检验检疫局检测无AVMs残留;10批鲜羊奶样品，市购。
1.2药品与主要试剂
AVM标准品(纯度为98.1%)、IVM标准品(纯度为94.4%)、DOM标准品(纯度为95.2%)、EPR标准品(纯度为94.5%)，购自Dr.Ehrenstorfer公司;EMM乙腈标准溶液(100μg/mL)，购自阿尔塔科技有限公司;乙腈(色谱纯)，购自美国TEDIA公司;甲酸(色谱纯)，购自Dikma公司;三乙胺(色谱纯)，购自天津市科密欧化学试剂有限公司;异辛烷(色谱纯)，购自CNW公司。
1.3主要仪器
超高效液相色谱-串联质谱仪(型号为UPLC-XevoTQ)、C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm，型号为ACQUITYUPLCBEH)、C18固相萃取柱(规格500mg/6mL)，均购自美国Waters公司;台式高速冷冻离心机(型号为H2100R)，购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;氮空吹扫仪(型号为SPT-24V)，购自北京斯波特科技有限公司;涡旋混合器(型号为MS3digital)，购自德国IKA公司;多位试管振荡器(型号为MultiReax)，购自德国Heidolph公司;十万分之一电子天平(型号为XA205DU)，购自瑞士梅特勒-托利多集团。
2方法
2.1主要溶液的配制
参考《农业部1025号公告-5-2008动物性食品中阿维菌素类药物残留检测———酶联免疫吸附法，高效液相色谱和液相色谱-串联质谱法》配制、储存相关溶液。
标准储备液:准确称取AVM标准品10.2mg、IVM标准品10.6mg、DOR标准品10.5mg、EPR标准品10.6mg，分别置100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释成浓度为100μg/mL的标准储备液，-18℃保存6个月。
标准工作液:分别准确移取IVM标准储备液和EMM乙腈标准溶液各50μL以及AVM、DOR和EPR标准储备液各200μL置10mL容量瓶中，用乙腈稀释使IVM、EMM浓度为0.5μg/mL，AVM、DOR和EPR浓度为2μg/mL，即为相应标准工作液，-18℃保存3个月。
洗涤液:乙腈30mL、水70mL和三乙胺20μL，混匀，现配现用。
2.2色谱条件
色谱柱为C18色谱柱;流动相A为0.1%甲酸水;流动相B为0.1%甲酸乙腈;流速为0.4mL/min;柱温为30℃;进样量为5μL;运行时间为6min。AVMs洗脱梯度见表1。
2.3质谱条件
电喷雾离子源正离子(ESI+)模式;检测方式为多反应监测(MRM);毛细管电压为3.5kV;离子源温度为150℃;脱溶剂气温度为300℃;脱溶剂气流速为800L/h;锥孔气流速为50L/h。监测特征离子、锥孔电压和碰撞能量等参数见表2。
2.4样品处理
2.4.1提取称取(2.0±0.2)g样品于50mL离心管中，加入乙腈8mL，2500r/min振荡混匀5min，10000r/min离心5min，转移上清液至另一支50mL离心管中，加入水10mL、三乙胺25μL，混匀，备用。2.4.2净化C18固相萃取柱依次用5mL乙腈、5mL洗涤液活化;备用液全部过C18固相萃取柱，流速为1mL/min;依次用5mL洗涤液、5mL异辛烷淋洗，抽干;用5mL乙腈洗脱，收集洗脱液置10mL玻璃试管中，于50℃水浴氮气吹干;用1mL50%乙腈水溶液溶解残余物，涡旋混匀30s;复溶液过0.22μm针孔滤膜待测定。
2.5线性范围和灵敏度测定
采用基质外标法。精密量取一定量的5种AVMs标准工作液，用空白羊奶基质提取液配制成IVM、EMM浓度分别为0.5，1，2，5，10，20，50μg/L及AVM、DOR、EPR浓度分别为2，4，8，20，40，80，200μg/L的系列基质标准工作溶液，现用现配。以AVMs浓度为横坐标，各特征离子的定量离子峰面积为纵坐标，根据基质标准曲线求得回归方程和相关系数(r)。
采用向空白羊奶中添加目标化合物的方法(加标回收法)，经前处理后测定相对峰度，来考察羊奶样品中目标化合物的分离效果，根据药物特征离子色谱峰(S/N)和对应的目标化合物浓度，将S/N≥3时的药物浓度确定为方法检出限，S/N≥10时的药物浓度确定为方法定量下限[9]。
2.6准确度和精密度测定
向空白羊奶中添加适宜浓度的5种AVMs标准工作液，即IVM、EMM的添加浓度为0.5，2，5μg/kg，AVM、DOR、EPR的添加浓度为2，8，20μg/kg。每个浓度进行6次平行试验，重复进行3个批次，计算回收率及批内、批间相对标准偏差，根据计算结果判断该方法的准确度和精密度是否均满足《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB/T27404—2008)[10]要求。
2.7基质效应评价
分别在纯试剂(流动相)和6批不同来源羊奶样品基质提取液(A、B、C、D、E、F)中添加5种AVMs标准工作液(IVM、EMM添加浓度5μg/L，AVM、DOR、EPR的添加浓度为20μg/L)，比较5种AVMs在6批不同来源羊奶样品基质提取液和纯试剂中的信号峰面积，得到5种AVMs在6批不同来源羊奶中的基质效应(matrixeffect，ME)，ME为AVMs在基质中的信号峰面积与AVMs在纯试剂中的信号峰面积的比值。判断标准[11]:ME值<100%，表示基质对分析物的响应产生抑制作用;ME值>100%，表示基质对分析物的响应产生增强作用;ME值=100%，表示不存在基质效应。
2.8实际应用
取10批鲜羊奶样品，应用本试验建立的超高效液相色谱-串联质谱法同时测定羊奶中5种AVMs的残留情况，并同时送秦皇岛出入境检验检疫局进行检测，比较两者差异。
3结果与分析
3.1线性范围和灵敏度测定
结果见表3。
由表3可知，IVM和EMM在0.5～50μg/L范围内，AVM、DOR和EPR在2～200μg/L范围内线性关系良好，r均达到0.9996以上。通过加标回收法测得IVM和EMM的检出限为0.2μg/kg，定量下限为0.5μg/kg;AVM、DOR和EPR的检出限均为1.0μg/kg，定量下限均为2.0μg/kg。
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应用试验建立的超高效液相色谱-串联质谱方法，测定加标空白羊奶基质中5种AVMs的色谱图见图1，在目标峰前后无杂质峰，样品基质干扰小。
3.2准确度和精密度测定
结果见表4。
由表4可知:0.5～5μg/kg添加浓度范围内，IVM的平均回收率在76.8%～108.0%之间，EMM的平均回收率在73.5%～88.0%之间;在2～20μg/kg添加浓度范围内，AVM的平均回收率在87.5%～102.0%之间，DOR的平均回收率在87.8%～101.0%之间，EPR的平均回收率在87.5～105.0%之间。5种AVMs的批内与批间变异系数均小于15.0%，该方法的准确度和精密度均满足《实验室质量控制规范食品理化检测》(GB/T27404—2008)[10]要求。
3.3基质效应测定
IVM的ME值在101.6%～106.8%之间，羊奶样品基质提取液对IVM有一定的增强作用;EMM、AVM、DOR和EPR的ME值在86.6%～99.2%之间，羊奶样品基质提取液对这4种AVMs有抑制作用。6批不同来源的羊奶样品对同一种AVMs的基质效应差异不明显，羊奶样品中5种AVMs的ME值均控制在85.0%～115.0%之间(见图2)，这与B.K.Matuszewski等[12]研究结果一致。
3.4实际应用效果
应用本试验建立的超高效液相色谱-串联质谱法检测10批鲜羊奶样品，其中有1份样品检出的IVM残留量为13.4μg/kg，其他样品均未检出AVMs残留，这与秦皇岛出入境检验检疫局的检测结果一致。
4讨论
4.1提取方法的选择
AVMs极性较弱，水溶性极低，微溶于正己烷和石油醚，易溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈等有机溶剂。研究发现:应用乙酸乙酯提取时提取液中含有大量脂肪;应用甲醇提取时杂质较多，色谱峰基线较高;乙腈能较好地沉淀蛋白质，减少脂肪等杂质干扰。本试验在不影响回收率的前提下，采用乙腈一次性提取，简化了提取过程，缩小了净化体积，缩短了检测时间，提高了检测效率。
4.2净化方法的选择
通过查阅相关报道和国家标准，比较了乙腈饱和正己烷的液-液萃取法、碱性氧化铝固相萃取柱、中性氧化铝固相萃取柱法、watersPrimHLB固相萃取柱法和C18固相萃取柱法对羊奶中AVMs的净化效果，结果表明:乙腈饱和正己烷的液-液萃取法除脂效果差，回收率低，回收率为28.5%～46.7%;在4种固相萃取柱法中，C18固相萃取柱法的净化效果最好，回收率均高于其他固相萃取柱法。故本试验选择C18固相萃取柱法对羊奶中AVMs进行净化。
4.3质谱条件的优化
根据现有国家标准和相关报道，多在电喷雾电离源模式下检测AVMs，如在ESI-模式下扫描AVMs的[M-H]-，在ESI+模式下扫描[M+H]+、[M+HN4]+、[M+Na]+等加合峰离子。可以分别配制质量浓度为500mg/L的5种AVMs单标溶液，以针泵方式注射到质谱，进行质谱条件优化。研究发现:在ESI-模式下很难监测到AVMs的[M-H]-离子，离子化效率极低;在ESI+模式下，可以扫描到[M+H]+、[M+HN4]+、[M+Na]+加合峰离子，但[M+H]+和[M+HN4]+加合峰的响应强度均低于[M+Na]+加合峰。结合液相方法发现，5种AVMs的[M+H]+和[M+HN4]+灵敏度比较低，而且AVM和EPR色谱峰分叉，峰型不好;相比之下，5种AVMs的[M+Na]+的灵敏度更高。
根据AVMs极性较弱的特性，结合秦皇岛市农产品质量安全检验监测中心实验室具备的条件和工作经验，选择C18色谱柱作为分离色谱柱。在ESI+模式下，比较了5种AVMs在乙腈-水和甲醇-水流动相体系中的色谱行为，结果目标化合物在乙腈-水流动相体系中分离度比较好，而且在流动相中加入0.1%甲酸，并按照表1中的洗脱程序进行，可提高分析物的离子响应和分离度，从而达到较高的灵敏度。
5结论
本试验建立的同时测定羊奶中5种AVMs残留的超高效液相色谱-串联质谱法，前处理过程简单，基质效应低，灵敏度高，精密度、准确度和各项技术指标符合食品中农兽药残留检测要求，可用于羊奶中AVMs残留的检测。——论文作者：李宏娟1，张养东2，李曼1，张嘉楠1，李鹏2，杨赵伟1*
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