【摘要】目的动态观察自发性2型糖尿病db/db小鼠肝产生的病理变化及特点，为将db/db小鼠肝作为2型糖尿病肝损伤模型的实验研究提供基础理论和实验依据。方法7～8周龄，雄性，SPF级db/m小鼠作为对照组，糖尿病db/db小鼠作为模型组，各16只。动态观察其体重、空腹血糖(fastingbloodglucose，FBG)、血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)活性，计算肝指数，光镜与电镜下观察肝的病理学改变。结果db/db小鼠空腹血糖、血清ALT、AST活性均明显高于db/m小鼠，组织学检查发现db/db小鼠肝在16周龄时就出现严重损害，主要表现为肝细胞脂肪变性、炎细胞浸润等;到32周龄时病变加剧，镜下可见肝组织内有大量的胶原纤维;电镜下可见线粒体、内质网等结构被破坏甚至消失，出现明显的脂滴、炎细胞，组织内含有大量的胶原纤维。结论db/db小鼠16周龄时肝出现明显的脂肪变性以及炎细胞浸润等，32周龄时表现为明显的纤维化，因此db/db小鼠的肝可作为实验研究时良好的2型糖尿病肝损伤模型。
【关键词】2型糖尿病;db/db小鼠;肝损伤;电子显微镜
2型糖尿病可对肝造成慢性进行性损伤，其肝并发症已成为研究热度较高的一类糖尿病并发症[1]。但糖尿病肝病变机制、具体病理改变等方面的研究还不够完善，防治仍有欠缺。db/db小鼠具有早期血糖升高、肝肾病变、胰岛功能缺陷等特点[2]，本文主要将不同时期db/db小鼠的肝与同源db/m小鼠的进行比较，为进一步以db/db小鼠肝作为2型糖尿病肝损伤模型的实验研究提供参考。
1材料和方法
1.1实验动物
SPF级db/db小鼠，体重33～38g，7～8周龄，雄性;SPF级db/m小鼠，体重18～22g，7～8周龄，雄性，购自常州卡文斯实验动物有限公司[SCXK(苏)2016-0010]，于华北理工大学动物实验中心SPF级屏障实验室[SYXK(冀)2015-0038]进行饲养，饲喂SPF级实验动物饲料(常州卡文斯实验动物有限公司)，并按照实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。该实验已通过华北理工大学动物实验伦理审查(编号:2017062)。
1.2主要试剂与仪器
丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);Masson三色法染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);苏木精染色剂(南京奥多福尼生物科技有限公司);伊红生物染色剂(上海展云化工有限公司)。罗氏血糖仪及试纸(德国罗氏诊断有限公司);真彩病理图像分析系统(高腾科技有限公司);高倍显微镜(日本奥林巴斯有限公司);透射电镜(日本日立公司)。
1.3实验方法
将购来的小鼠适应性饲养一周，剔除不合格小鼠，随机选取16只db/m小鼠作为对照组，16只db/db小鼠作为模型组，观察小鼠一般状态，饲养至32周龄。
1.3.1体重及空腹血糖的测定
分别在实验开始第一周(小鼠8周龄)、小鼠16周龄、32周龄时检测体重，并在禁食8h后尾静脉取血测血糖。
1.3.2血液肝功指标以及肝指数测定
在小鼠16、32周龄时禁食12h，麻醉后腹主动脉取血，全自动生化分析仪测定血清ALT、AST活性。于小鼠16、32周龄时，将db/m和db/db小鼠各处死8只，并分离肝组织。肝指数(liverindex，LI)=[肝重量(g)/体重(g)]×100%。
1.3.3光镜下观察肝组织学结构
将称重后的肝迅速固定，常规石蜡包埋、切片、烤片，然后分别进行HE染色和Masson染色。所有染片在光镜下观察并拍片。
1.3.4电镜下观察肝组织超微结构
小鼠肝组织切块，常规双重固定，梯度酒精脱水，100%酒精∶丙酮(1∶1)浸透，纯丙酮浸透，丙酮∶树脂(1∶1)混合液37℃温箱过夜，纯树脂(815/812混合液)浸透，Epon812包埋，半薄切片甲苯胺蓝染色，超薄切片厚度为50nm，经醋酸铀和柠檬酸铅电子染色后，电镜下观察并拍片。
1.4统计学方法
采用SPSS17.0统计软件，各组数据均用平均数±标准差(x±s珋)表示，采用单因素方差分析，两两对比，P<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1db/db小鼠体重及空腹血糖动态变化
如表1所示，饲养期间db/db小鼠体重一直高于db/m小鼠(P<0.01)。db/db小鼠的空腹血糖从8周龄时开始，便显著高于db/m小鼠(P<0.01)，而且一直保持较高的水平。随着饲养时间的延长，db/db小鼠的体重及空腹血糖也逐渐升高。
2.2db/db小鼠血清ALT、AST活性的动态变化
如表2所示，16周龄时db/db小鼠血清ALT、AST活性均明显高于db/m小鼠(P<0.01，P<0.05)。32周龄时db/db小鼠血清ALT、AST活性均有降低，相较db/m小鼠差异无显著性(P>0.05)，但与16周龄的db/db小鼠相比，血清ALT活性降低且差异有显著性(P<0.05)。
2.3db/db小鼠肝指数动态变化
如表3所示，db/db小鼠的肝指数(LI)在16和32周龄时均高于db/m小鼠(P<0.01)，16周龄时升高更为显著，到32周龄时db/db小鼠的肝指数较16周龄时有所降低(P<0.05)。
2.4肝组织在光镜下观察到的组织学结构改变
HE染色(图1):光镜下db/m小鼠(图A1、B1)16周龄和32周龄时均表现正常，肝板围绕着中央静脉规则排列，细胞边界清晰，胞质内含细胞核一个或两个;db/db小鼠16周龄时(图A2)肝组织中细胞排列紊乱，胞核消失，细胞坏死，炎症细胞浸润，可见大小不等的脂滴空泡，肝细胞体积增大，细胞核大小不一;32周龄时(图B2)脂滴空泡明显减少，炎细胞浸润明显，肝细胞大量坏死，肝板、肝血窦等结构已无法辨认。
Masson染色(图2):db/m小鼠(图A1、B1)仅在中央静脉周围可见极少量的蓝染胶原纤维;db/db小鼠16周龄时(图A2)可见大量脂滴空泡，中央静脉周围和组织内均有少量蓝染的胶原纤维，纤维化程度较正常组严重;32周龄时(图B2)大量的胶原纤维分布于肝组织内，纤维化明显。
2.5肝组织在电镜下观察到的超微结构改变
电镜(图3):db/m小鼠(图A1、B1)肝细胞内细胞核边界明显、核仁清晰，胞浆中线粒体数量多且形状规则，可见内质网等结构;db/db小鼠胞质内线粒体、内质网等结构被破坏，16周龄时(图A2)胞浆中出现大量脂滴空泡;32周龄时(图B2)肝细胞正常结构几乎消失，肝组织内代之以大量的胶原纤维。
3讨论
本实验动态观察了db/db小鼠肝功能及其组织病理形态结构的变化。结果表明，随着时间的推移，db/db小鼠体重、空腹血糖逐渐升高，并显著高于db/m小鼠;解剖见腹腔有大量脂肪蓄积，表明db/db小鼠糖脂代谢明显紊乱，这点与文献报道一致[3];db/db小鼠16周龄时，血清ALT、AST水平均高于db/m小鼠(P<0.05);db/db小鼠32周龄时仍相对db/m小鼠较高，但差异无显著性，而与db/db小鼠16周龄时相比较，ALT活性降低且差异有的升高提示肝具有明显病变。db/db小鼠的肝指数均高于对照组(P<0.01)，而32周龄时db/db小鼠的肝指数小于16周龄(P<0.05)，这可能是随着实验的进展db/db小鼠体重增加所致。肝的病理学观察发现，db/db小鼠在16周龄时的明显病变为脂肪病变，伴有小部分细胞坏死，炎细胞浸润等，与相关报道相符[6]，这提示我们在实验研究中获取糖尿病脂肪肝模型时，应在小鼠成长至16周龄左右时较为合适;而到32周龄时肝脂肪变性已不明显而代之以肝纤维化和肝硬化，此病理变化过程与糖尿病患者的肝损伤的发展过程基本一致。
2型糖尿病与肝病变之间有着复杂的牵连，研究发现其引起的肝损伤以非酒精性脂肪性肝病最常见[7]。目前临床用于治疗糖尿病的药物如二甲双胍、磺脲类药物、TZDs、DPP-4等多禁用于肝功能不全的患者或会对一般患者的肝造成一定程度上的损伤[8]，这就限制了糖尿病降糖药物的应用。因此，观察糖尿病慢性肝损伤的病理特点和肝功能变化在研究糖尿病肝病的病程发生发展规律及降糖药物对肝损伤的治疗作用时具有非常重要的意义。
目前已发表文献中用db/db小鼠作2型糖尿病模型时，以它作自身对照、饲养至20周以上的相对较少，本实验通过对比db/db小鼠16周龄时和32周龄时的肝的病理变化特点，为db/db小鼠作为2型糖尿病肝损伤模型以及不同时期的肝损伤模型的选择提供了依据。
自发性2型糖尿病db/db小鼠肝病理损伤特点相关期刊推荐：《中国实验动物学报》(双月刊)1993年创刊，是由中国实验动物学会主办并发行的国家级学术期刊。刊载内容：刊载有关实验动物和动物实验的理论专著、科研成果论文、科学实验新方法、新材料、实验动物新资源开发、新的动物品系的培育和应用以及与实验动物相关的其他学科的科学论述。
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