摘要:目的建立用于检测吲哚菁绿中甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙醚、三乙胺、邻二甲苯、吡啶8种残留有机溶剂的方法。方法采用顶空气相色谱法，氢火焰离子化检测器;载气为氮气，流速2.0mL·min-1;色谱柱为SE-30毛细管柱(50m×0.53mm，7μm);升温程序;进样口温度为250℃;检测器温度为300℃;分流进样，分流比为1∶20;顶空平衡温度为85℃，顶空平衡时间为30min。以标准溶液加入法用峰面积计算残留溶剂的含量。结果甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙醚、三乙胺、邻二甲苯、吡啶的线性关系良好(r=0.9989～0.9996)，甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、三乙胺、邻二甲苯的平均回收率均在85.0%～110.0%范围内。吡啶的平均回收率在80.0%～115.0%之间。结论经方法学验证表明，所建立的实验方法适用于吲哚菁绿原料药中8种残留有机溶剂的含量测定。
关键词:吲哚菁绿;顶空气相色谱法;残留溶剂
吲哚菁绿(indocyaninegreen，ICG，中文别名靛氰绿)，化学名称为2，7-双[1，3-二氢-1，1-二甲基-3-(4-磺丁基)-1，3，5-庚三烯单钠盐，呈暗绿青色或暗棕红色粉末，无臭，遇光容易变质[1-3]，化学结构式见图1。ICG是一种全合成的三羧花青系诊断试剂，1955年由美国柯达实验室研发，是目前唯一被美国食品药物管理局(FDA)批准用于临床的近红外成像试剂[4]，也是我国心血管系统疾病临床诊断中常用的造影剂[5-7]。
吲哚菁绿合成中用到的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、三乙胺、邻二甲苯、吡啶，这些溶剂会对人体和环境造成不良影响，但在生产过程中又不能完全去除。根据人用药物注册技术要求国际协调会(InternationalConferenceonHarmonization，ICH)和《中国药典》2015版第四部通则0861残留溶剂检查法的相关规定，需对这8种有机溶剂的残留量进行检测与控制。参考药物残留溶剂测定的相关文献[8-14]，本文作者建立了顶空气相色谱法测定吲哚菁绿原料中甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙醚、三乙胺、邻二甲苯、吡啶8种有机溶剂的含量，所建立的方法可用于实际生产中产品的质量控制。Fig1Chemicalstructureofindocyaninegreen图1吲哚菁绿的化学结构式
1仪器与材料
安捷伦7890B气相色谱仪、7697A顶空进样器、7890B气相色谱工作站、氢火焰离子化检测器(美国Agilent公司)，SE-30石英毛细管柱(50m×0.53mm，7μm，大连中汇达有限公司)，XS-205电子天平(瑞士MettlerToledo公司)。
吲哚菁绿原料药(批号170606)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，氯化钠、氢氧化钠(分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司)，甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、三乙胺、吡啶、邻二甲苯(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，超纯水(自制)。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为SE-30石英毛细管柱(50m×0.53mm，7μm);升温程序:初始温度40℃，保持8min，以5℃·min-1升温至80℃，维持5min，以10℃·min-1升温至180℃，维持10min;载气为氮气，流速为2mL·min-1;进样口温度为250℃，分流比为1∶20;检测器(FID)温度为300℃;顶空进样，顶空平衡温度为85℃，平衡时间为30min。
2.2溶液的配制
2.2.1稀释液
稀释液-1:精密量取DMF200mL和水200mL置500mL量瓶中，混匀，加入1mol·L-1NaCl溶液50mL，混匀，作为稀释液-1，备用(专供供试品溶液配制)。
稀释液-2:精密量取DMF400mL和水400mL置1000mL量瓶中，混匀，加1mol·L-1NaOH溶液100mL，混匀，作为稀释液-2，备用(空白溶液)。
2.2.2对照品溶液
对照品储备液1:精密称取乙醚125mg、三乙胺125mg、丙酮125mg、甲醇75mg、乙醇125mg、正丁醇125mg和邻二甲苯54.25mg，置50ml量瓶中，加稀释液-2至1/3体积处。
对照品储备液2:精密称取吡啶100mg，置50mL量瓶中，加稀释液-2至刻度，摇匀，得对照品储备液2。混合对照品储备液:精密量取2.5mL对照储备液2置于对照品储备液1中，加稀释液-2至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。
混合对照品溶液:精密量取混合对照品储备液5.0mL，置50mL量瓶中，加稀释液-2稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。
标准加入法混合对照品溶液:精密量取供试品溶液2.0mL，置20mL顶空瓶中，精密加入混合对照品溶液2.0mL，密封，即得标准加入法混合对照品溶液。
2.2.3供试品溶液
精密称定吲哚菁绿原料药(批号170606)0.5g，置10mL量瓶中，加入稀释液-1至1/3体积处，超声5min，放冷至室温，用稀释液-1定容至刻度，摇匀，即得供试品储备液。
精密量取供试品储备液2.0mL，置20mL顶空瓶中，精密加入2.0mL稀释液-1，密封，即得供试品溶液。
2.3方法学验证
2.3.1系统适用性试验
取“2.2”条下稀释液-2(空白溶液)、标准加入法混合对照品溶液、供试品溶液，按照“2.1”条下色谱条件分别顶空进样，记录色谱图及数据，见图2。结果表明，空白溶液在各有机溶剂峰出峰位置无干扰，各组分峰之间均能有效分离，标准加入法混合对照品溶液中各溶剂峰面积的相对标准偏差(RSD%)均小于10.0%，见表1。系统适用性符合测定要求。
2.3.2专属性试验
按照“2.1”条下色谱条件混合对照品溶液、稀释液-2、供试品溶液分别顶空进样。记录相关数据，见表2，结果表明稀释液-2和供试品溶液中杂质对各溶剂检测无干扰，各溶剂峰完全分离(R>1.5)，符合残留溶剂测定专属性的要求。
2.3.3标准曲线与线性范围
精密吸取混合对照储备液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL分置10mL量瓶中，加稀释液-2稀释至刻度，摇匀。精密吸取各浓度溶液2.0mL分置20mL顶空瓶中，加入2.0mL供试品溶液，密封，摇匀即得系列标准曲线溶液。按照“2.1”条下色谱条件进样测定。以质量浓度(mg·L-1)为横坐标，以峰面积A为纵坐标，进行线性回归分析。结果见表3，表明8种溶剂在各自的质量浓度范围内呈现良好的线性关系。
2.3.4准确度试验
精密吸取混合对照品储备液0.8、1.0、1.2mL，分置10mL量瓶中，加稀释液-2稀释至刻度，摇匀。精密吸取2mL分置20mL顶空瓶中，加入2.0mL供试品溶液，密封。每个制备3份，按照“2.1”条下色谱条件各浓度分别顶空进样，计算平均回收率。结果见表4，甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、正丁醇、三乙胺、邻二甲苯的平均回收率均在85.0%～110.0%范围内，吡啶的平均回收率在80.0%～115.0%范围内，符合残留溶剂测定准确度的要求。
2.3.5精密度试验
精密量取“2.2.2”条下的混合对照品溶液6份，在“2.1”条下色谱条件进样分析，记录各溶剂色谱峰面积，结果见表5，RSD均小于10.0%，说明色谱系统精密度好。
取同一批次吲哚菁绿(批号170606)，按照“2.2”条下方法制的6份供试品溶液和1份标准加入法混合对照品溶液，在“2.1”条下色谱条件进样分析。计算供试品溶液中各溶剂含量的相对标准偏差(RSD)。结果见表6，检出供试品溶液中达到报告限度的溶剂有甲醇和丙酮，其含量%的RSD%分别为8.6%和3.6%，供试品溶液中各溶剂含量的相对标准偏差(RSD)≤10%。其余溶剂均未检出。
2.3.6耐用性试验
按“2.1”条下色谱条件，其他条件不变，分别改变起始柱温38℃、42℃，载气流量1.9、2.1mL·min-1，改变色谱柱型号，取供试品溶液进样分析，考察改变条件对系统适用性和检测结果的影响。结果见表7、表8。结果表明，当实验条件有小的变动时，能够满足系统适用性要求，耐用性良好。
3讨论
3.1溶剂的选择
三乙胺在供试品中以三乙胺盐酸盐形式存在，配制成供试品溶液后游离三乙胺较少，给检查带来困难，如峰形差，响应低。为提高三乙胺检测效率，尝试改变溶剂，气相检测中常用一定比例的水和有机溶剂混合作为溶剂，本法拟采用H2ODMF(1∶1)为基础溶剂，并加入一定量氯化钠，以加速三乙胺盐酸盐转化为三乙胺。为验证此方法，分别采用不加氯化钠和加氯化钠的溶剂溶解三乙胺盐酸盐，结果表明前者在色谱条件下不出峰，后者峰形较好。证明改变溶剂有助于三乙胺的检出。
3.2进样方式的选择
由于各残留溶剂沸点和极性不同，故选择溶解性较强的DMF作为溶剂，使用非极性固定相，程序升温，直接进样，结果显示各残留溶剂分离度良好(R>1.5)，但三乙胺的峰形严重拖尾，吡啶峰响应值低，不能达到检查要求。由于三乙胺在供试品中以盐酸盐形式存在，在直接进样方式下无法快速游离出来从而被准确检测到。吡啶作为二类溶剂允许残留限度较低(0.02%)，提高供试品浓度会对色谱柱造成损害。采用顶空进样的方式，结果表明三乙胺峰形得到改善，通过提高供试品浓度，改变分流比等吡啶达到检查要求。
3.3定量计算方式
外标法为色谱方法中常用定量方法，采用外标法对供试品中各残留溶剂定量，结果表明外标法精密度较好，但回收率试验中三乙胺存在严重基质效应，供试品溶液中三乙胺的峰面积仅为对照品溶液中峰面积的一半，因此不宜采用外标法进行定量。故使用标准溶液加入法，排除供试品对残留溶剂检测的影响。
4结论
本文作者所建立的测定吲哚菁绿原料药中8种有机溶剂残留量的方法简便、准确。实验结果表明，该方法适用于吲哚菁绿原料药中8种有机残留溶剂的含量测定，能够满足实际药品检测的需要，控制药品质量，同时也可为从事多组分残留溶剂检测的分析工作者提供参考。
顶空毛细管气相色谱法测定吲哚菁绿中溶剂残留量相关期刊推荐：《沈阳药科大学学报》(月刊)创刊于1957年，是由沈阳药科大学主办的药学类科技期刊。1987年被国家科委批准为国家级刊物，现已被美国化学文摘(CA)、俄罗斯文摘杂志(AJ)、日本科学技术社数据库、中国药学文摘等文摘性杂志所收录。本刊主要刊登：药剂、药物化学、药物分析、药理、生物药学、医药经济、综述等方面的论文。有打算投稿的作者，可以咨询在线编辑。
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