摘要：采用chelex-00法提取内蒙古地区4种白粉菌的基因组DNA，扩增其rDNA内转录间隔区序列ITS，连接载体测序，并基于ITS序列进行亲缘关系分析。结果表明，4种白粉菌形成3个进化距离较远的分支;寄生在豌豆和田旋花上的豌豆白粉菌和旋花白粉菌的ITS序列紧密聚在支，其亲缘关系较近，同属白粉菌属;寄生在紫花苜蓿上的托罗斯内丝白粉菌和寄生在山桃上的三指单囊白粉菌各自成支，与形态学分类结果相一致。ITS序列可用于内蒙古地区白粉菌分类鉴定研究。
关键词：白粉菌;内转录间隔区;亲缘关系;内蒙古;序列分析
白粉菌(powdery mildews)是重要的植物病原菌，目前至少报道了25个属873种，其中，有性型6个属，无性型9个属，由白粉菌引起的植物病害统称为白粉病。白粉病在世界各地均有发生，寄主植物至少有 67属9 838种被子植物[2]。近年来，我国由于玻璃温室、塑料大棚和密植等栽培模式和耕作制度的改变，为作物白粉病的发生创造了良好的环境，常常造成瓜果、蔬菜和花卉等白粉病的大流行，白粉病发生相当普遍和严重，给农业生产带来重大的经济损失。在许多地区，如芍药、醉蝶花、荷兰菊等观赏花卉白粉病的发病率几乎达到00%，林木和牧草白粉病更是随处可见。
内蒙古自治区是典型的的中温带季风气候地区，植物种类复杂多样，为专性寄生的白粉菌提供了优越的生长发育条件，通过经典分类方法已鉴定出白粉菌0属23个种和变种，寄主植物多达58科2属400多种和变种[3]。农业是内蒙古的主要产业之一，为避免白粉菌对农业造成的经济损失，对内蒙古自治区农作物白粉菌进行系统分类研究很有必要。近几年，随着分子生物学的发展，对白粉菌系统分类研究已由传统的经典分类向分子生物方法分类过渡。本试验对内蒙古自治区采集的白粉菌样本进行rDNA-ITS序列分析及比对，构建白粉菌系统发育树，从分子系统学角度探讨不同白粉菌之间的亲缘关系，以期为白粉菌的分类鉴定及系统发育等方面的研究提供依据，为该地区植物白粉病的有效防治及物种多样性的研究提供科学依据及资料。
材料与方法
菌种样本采集
在内蒙古自治区采集4种白粉菌样本，寄主分别是豌豆(标本号：CFSZ 559)、田旋花(样本号：CFSZ7249)、紫花苜蓿(样本号：CFSZ7253)、山桃(样本号：CFSZ7257)，保存于赤峰学院生命科学学院菌物实验室。
2白粉菌孢子收集
白粉菌是专性寄生菌，只在活体寄主上生存，因此，将病菌样本尽快带回实验室，在新鲜寄主植物表面，用灭菌的解剖针在显微镜下挑取大概数百个分生孢子，将其置于5 mL离心管中-20 ℃冰箱中保存，以备提取基因组DNA。
3主要试剂
[3]Chelex-00，购自美国伯乐公司;Taq酶、XbalⅠ、Hind Ⅲ、质粒DNA提取试剂盒、CR产物纯化试剂盒和pMD 8-T Vector，均购自大连宝生物公司;通用引物ITS：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′、ITS4：5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′、ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′、ITS6：5′-AGGTAATCCCGGTTGGTTTC-3′[4]，均由大连宝生物公司合成。
4白粉菌基因组DNA的提取
选取数百个分生孢子置于5 mL离心管中，加入50 μL 5% Chelex-00，56 ℃温育数小时;涡旋振荡仪剧烈振荡，沸水浴8 min;再次剧烈振荡，5 000 g离心5 min;上清移入另一离心管中，-20 ℃保存备用[5]。
5ITS序列的CR扩增
采用巢式CR方法，以提取的基因组DNA作为模板进行CR扩增。一次CR总体积为50 μL，反应参数为：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30次;72 ℃ 0 min。二次CR总体积为50 μL，反应参数为：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30次;72 ℃ 0 min。将CR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。
6CR产物的克隆及序列测定
CR产物的回收与纯化参照TaKaRa DNA Fragment urification Kit试剂盒说明进行，并与 pMD 8-T 载体连接转化于DH5α感受态细胞，用CR法和 XbalⅠ、Hind Ⅲ双酶切法筛选阳性克隆菌株，送大连宝生物生物技术有限公司测序。
7ITS序列的生物信息学分析
利用Clustal X程序将4种不同植物白粉病菌的ITS序列匹配排列，用MEGA 60软件对序列进行比对分析，基于kimura-2-parameter双参数模型，采用邻近距离法(N法)构建系统进化树以推演系统发生关系，同时，采用bootstrap法，经000次循环检验系统进化树的可靠性。
2结果与分析
2CR扩增结果
[2]由图、图2可见，采用真菌通用引物ITS5和ITS6作为外引物，ITS和ITS4作为内引物，对4种白粉菌基因组DNA进行扩增，均得到600 bp左右的DNA片段。测序结果表明，该片段包括了完整的核糖体内转录间隔区ITS和ITS2序列、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。
22白粉病菌ITS序列分析和进化树的构建
将已测得的序列去掉5′和3′端的载体序列，得到4种白粉菌的ITS序列，用Clustal X软件中Alignment程序对ITS序列进行多重比对，结果由表、图3可见，4种白粉菌部分8 S rDNA、全部58 S rDNA序列和部分28 S rDNA序列非常保守，而内转录间隔区ITS和ITS2序列变化较大。基于ITS序列，利用MEGA 60对4种白粉菌进行系统发育分析和进化树的构建，由图4可见，4种白粉菌形成3个进化距离较远的大分支;寄生在豌豆(CFSZ 559)和田旋花(CFSZ7249)上的白粉菌遗传距离较小，亲缘关系较近，其ITS序列紧密聚在支;寄生在紫花苜蓿(CFSZ7253)上的托罗斯内丝白粉菌和寄生在山桃(CFSZ7257)上的三指单囊白粉菌各自成支，ITS序列分析结果与其在形态学上的分类结果相一致。
3结论
本研究对来自于内蒙古自治区不同属的4种白粉菌进行ITS序列克隆，已成功克隆出白粉菌的ITS序列包括内转录间隔区ITS和ITS2、部分8S rDNA、全部58S rDNA序列及部分28S rDNA序列。通过序列对比分析发现，部分8S rDNA、全部58S rDNA序列和部分28S rDNA序列核糖体编码区非常保守，适合亲缘关系较远的类群分析[6]，而ITS和ITS2变化较大，可用于亲缘关系较近类群的分析。基于ITS序列比对，利用MEGA 60对4种白粉菌进行系统发育分析和进化树的构建，内蒙古自治区4种白粉菌种属间亲缘关系的结果与传统的形态学分类结果相一致，这表明ITS序列可用于白粉菌属内和属间的亲缘关系和分类分析。
本研究获得了一种通过扩增ITS序列进行亲缘关系和分类分析快速而有效的方法，这为内蒙古自治区白粉菌分子系统学的研究和植物白粉病的防治，提供了理论参考和相关依据。
参考文献：
[2]Amano K Host range and geographical distribution of the powdery mildew fungi [M]2nd ed Tokyo：apan Scientific Societies ress，986
[3]刘铁志 内蒙古白粉菌志[M] 呼和浩特：内蒙古科学技术出版社，200：-322
[4]Takamatsu S，Limkaisang S，Braun U hylogenetic relationships and generic affinity of Uncinula septata inferred from nuclear rDNA sequences Mycoscience，2005，46()：9-6
[5][2]Hirata T，Takamatsu S Nucleotide sequence diversity of rDNA internal transcribed spacers extracted from conidia and cleistothecia of several powdery mildew fungi Mycoscience，996，37(3)：283-288
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