摘要：通过比较不同采收时间对浙江桐庐杭白芍中总皂苷和芍药苷含量的影响，确定最佳采收期。采用分光光度计和HPLC法分别测定不同采收年份和季节的桐庐杭白芍中总皂苷和芍药苷的含量。结果显示，四年间桐庐杭白芍中总皂苷和芍药苷的含量随年份递增，四年生杭白芍根中的总皂苷和芍药苷平均含量分别达到18.21% 和2.21%。二年生桐庐杭白芍根中的总皂苷和芍药苷含量在第四季度平均含量最高，分别为11.78% 和1.51%。结合有关桐庐土壤菌群的文献发现，桐庐杭白芍根的总皂苷、芍药苷含量于第二季度增长最多并于次年第一季度降低的现象与土壤菌群数量、多样性变化一致。总之，杭白芍的道地性与桐庐当地土壤环境紧密相关，杭白芍以四年生、第四季度采收最佳，其总皂苷、芍药苷的含量变化与土壤菌群有关。
关键词：杭白芍;总皂苷;芍药苷;采收期
论文《生长时间对杭白芍总皂苷和芍药苷含量的影响》发表在《广东农工商职业技术学院学报》，版权归《广东农工商职业技术学院学报》所有。本文来自网络平台，仅供参考。
白芍是毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根，主产于浙江东阳、磐安(杭白芍)及安徽亳州(亳白芍)，具有调经养血、敛阴平肝、止痛止汗的功能，常用于治疗头痛眩晕、腹痛胁痛、四肢挛痛、月经不调、血虚萎黄、自汗盗汗。芍药苷具有吸湿性，在解痉镇静、抗炎抗应激性溃疡等多方面发挥作用，为白芍的主要有效成分之一。
桐庐是中医药文化的起源地之一，属中亚热带气候，四季分明，温暖湿润，阳光充足，雨水充沛。这样独特的地理和气候环境为中草药的生长提供了绝佳的条件。桐庐地区有丰富的中药材资源，种类达到数百种。杭白芍是著名的“浙八味”之一，杭白芍药材种植中，对其芍药苷的含量影响较显著的两个因素是采收时间和加工方法，因此值得关注白芍的采期、生长环境和种植条件。本文主要研究了桐庐当地种植环境下杭白芍不同采收时期对芍药总皂苷和芍药苷含量的影响，讨论了活性成分与土壤菌群间的关系，为杭白芍栽培精准化过程中提高和控制药材质量提供依据。
一、仪器与试药
LC-20ATvp高效液相色谱系统和Prominence紫外检测器(日本岛津公司);齐墩果酸对照品(上海源叶生物科技有限公司)，芍药苷对照品(上海源叶生物科技有限公司)，杭白芍药材(桐庐鑫旺中药材有限公司)，甲醇、乙腈为色谱纯，乙醇、磷酸为分析纯，水为重蒸馏去离子水。
二、方法
(一)色谱条件
色谱柱:Agilent TC-C18色谱柱(5 µm,150 mm×4.6mm);流动相:乙腈-0.1%磷酸=15:85(V/V);检测波长:230 nm;流速:1 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:25 μL。
(二)对照品溶液的制备
精密称取5.24 mg已干燥至恒重的齐墩果酸对照品，溶解于甲醇中并定容，制成浓度0.524 mg/mL的溶液作为对照品溶液。精密称取5.24 mg已干燥至恒重的芍药苷对照品，溶解于甲醇中并定容，制成浓度0.524 mg/mL的溶液作为对照品溶液。
(三)供试品溶液的制备
分别于同一地域种植基地内采收种植一年、二年、三年和四年的杭白芍植株，同时分别于种植第二年的第一季度、第二季度、第三季度和第四季度采收杭白芍植株，于实验室内分拣出根、茎、叶等器官，并于实验室自然晾干。然后每份取约0.5 g，精密称定后，置150 mL具塞锥形瓶中，加20 mL甲醇，在超声波清洗器中超声40 min，在80 ℃水浴条件下使甲醇挥干，再加20 mL热水溶解，用乙醚脱脂两次，每次20 mL，用水饱和的正丁醇溶液萃取水层四次，每次50 mL，收集正丁醇液，加2倍5%氨水试液洗涤两次。将正丁醇挥干，用甲醇于5 mL容量瓶中定容至刻度，过滤，取续滤液1 mL，用甲醇于10 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。
(四)总芍药苷检测波长的确定
在10 mL具塞刻度试管中精密加入0.2 mL对照品溶液，在80 ℃水浴条件下使甲醇挥干，冷却后准确加入0.5 mL的5%香草醛乙酸-高氯酸溶液，立即摇匀，在60 ℃恒温水浴条件下充分加热15 min，取出，冷却5 min，准确加入3 mL冰醋酸，摇匀，静置5 min，以空白溶液为对照，在波长400 nm~700 nm范围内扫描，结果显示齐墩果酸最大吸收波长在545 nm处，因此选择545 nm为检测波长。
(五)总芍药苷的方法学考察
1. 显色稳定性考察
取1 mL齐墩果酸对照品溶液(0.524 mg/mL)于10 mL容量瓶中，加1 mL显色剂，甲醇定容，分别在1 min、5 min、10 min、20 min、30 min、60 min、90 min、120 min时测定吸光度A值。同时另取1 mL样品溶液于10 mL容量瓶中，加1 mL显色剂，甲醇定容，分别在上述时间测定吸光度A值。结果显示，对照品溶液和样品溶液显色后在10 min~2 h内吸光度A值基本不变，表明显色稳定。
表1 不同时间标准品和样品的吸光度
|时间 (min)|1|5|10|20|30|60|90|120|
|标准品|0.20|0.31|0.33|0.33|0.33|0.33|0.33|0.32|
|样品|0.38|0.51|0.52|0.52|0.52|0.53|0.53|0.52|
表2 回收率测定
|样品|加入量(mg)|测得量(mg)|回收率(%)|平均回收率(%)|RSD (%)|
|1|2.82|2.79|98.9|99.5|1.36|
|2|2.82|2.85|101.1| | |
|3|2.82|2.78|98.6| | |
2. 线性关系考察和标准曲线建立
分别精密吸取浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL的齐墩果酸对照品储备液适量，按确定检测波长测定吸光度值，以对照品溶液浓度C为横坐标、对应的吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数(r)。所检测齐墩果酸标准曲线为：$A=1.0995 C+0.0838(r=0.9999)$，表明线性关系较好，能满足总皂苷含量测定。
精密吸取0.2 mL供试品溶液于10 mL具塞刻度试管中，按上述方法处理后于545 nm测吸光度，平行测定三次，代入标准曲线方程求得总皂苷浓度，根据稀释倍数和取样质量计算含量(%)。
3. 精密度考察
取一定浓度的齐墩果酸对照品溶液连续测定3次，读取吸光度，计算RSD值。结果显示齐墩果酸$RSD=0.35 \%(n=3)$，表明仪器精密度良好。
4. 重现性试验
取3份相同的白芍样品，平行制备3份样品溶液，测得总皂苷含量$RSD=2.33 \%(n=3)$，芍药苷$RSD=1.02 \%(n=3)$，表明试验重现性良好。
5. 加样回收率试验
取已知含量的白芍样品3份各10 g，定量加入2.82 mg齐墩果酸对照品，按处理方法测定总皂苷含量，结果显示平均回收率为99.5%，$RSD=1.36 \%(n=3)$，表明测定方法回收率较好。
(六)芍药苷的方法学考察
1. 稳定性考察
取同一批样品，制备4份供试品溶液，分别在0 h、12 h和24 h进样分析，测定芍药苷峰面积。结果显示，芍药苷$RSD=1.96 \%$，表明芍药苷在0h-24h内稳定性较好。
2. 线性关系考察和标准曲线建立
以甲醇精密配置浓度分别为5.0 mg/L、10.0 mg/L、50.0 mg/L、100.0 mg/L、500.0 mg/L、1000.0 mg/L的芍药苷标准液，各进10 μL溶液，得到色谱流出曲线。以芍药苷浓度(mg/L)为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数(r)。所检测芍药苷标准曲线为：$A=18825C-182248 (r=0.9998)$，表明线性关系较好。精密吸取供试品溶液10 μL进样，按方法测定并记录色谱图。
3. 精密度考察
制备低、中、高浓度标准样品5.0 mg/L、50.0 mg/L和500.0 mg/L作为质控样品(QC)，每个浓度样品重复3次进样分析，计算峰面积变异系数(RSD)。结果显示芍药苷的变异系数小于10%，精密度符合检测标准。
表3 芍药苷精密度(n=3)
|添加浓度(mg/L)|芍药苷(%)|
|5.0|3.35|
|50.0|3.16|
|500.0|2.67|
4. 重现性试验
取同一批芍药苷标准液，制备3份供试品溶液，进样分析并计算峰面积平均值、标准差及RSD。结果显示芍药苷RSD=1.02% (n=3)，表明试验重现性良好。
5. 加样回收率试验
准确吸取0.1 mL浓度为100 mg/L的芍药苷标准液，加入0.1 mL上述样品，超声混匀后按方法检测，计算加样回收率。结果显示芍药苷平均回收率为99.56%，表明测定方法回收率较好。
(七)数据统计与分析
采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计学分析，计算平均值及标准差;使用Excel软件作图。
三、结果和讨论
(一)不同采收年份和采收季节总皂苷含量的影响
不同年份杭白芍中总皂苷含量测定结果见表4，四年间杭白芍中总皂苷的含量随年份的增加而提高，其中第三年提高幅度最大，四年生杭白芍根中的总皂苷平均含量达到18.21%。
表4 不同年份杭白芍中总皂苷含量(%)
|采样年份|根(%)|
|一年生|9.08±1.07|
|二年生|11.78±0.39|
|三年生|16.37±2.73|
|四年生|18.21±2.19|
选择二年生杭白芍考察不同季节总皂苷含量，结果见表5，第四季度杭白芍根中的总皂苷含量最高，达到11.78%;且第二、三季度的二年生杭白芍根中的芍药苷含量远大于茎中的。同时发现，第一季度的二年生杭白芍根中的总皂苷含量相比一年生反而有所降低，可能与取样或春季杭白芍开始生长茎叶，总皂苷向茎叶中分布迁移有关。
表5 二年生杭白芍中不同季节总皂苷含量(%)
|采样季度|根(%)|茎(%)|
|一季度|7.86±0.23|——|
|二季度|9.85±0.39|4.14±0.25|
|三季度|10.41±0.71|5.74±0.46|
|四季度|11.78±0.39|——|
(二)不同采收时间芍药苷含量
不同年份杭白芍中芍药苷含量测定结果见表6，四年间芍药苷的含量随年份的增加而提高，其中第三年提高幅度最大，四年生杭白芍根中的芍药苷含量达到2.21%。
表6 不同年份杭白芍中芍药苷含量(%)
|采样年份|根(%)|
|一年生|1.38±0.16|
|二年生|1.51±0.29|
|三年生|1.94±0.36|
|四年生|2.21±0.43|
选择二年生杭白芍考察不同季节芍药苷含量，结果见表7，第四季度杭白芍根中的芍药苷含量最高，达到1.51%;且第二、三季度的二年生杭白芍根中的芍药苷含量均多于茎中的。同时发现二年生杭白芍根中的芍药苷含量相比一年生基本持平，说明冬季杭白芍处于休眠期。
表7 不同季节二年生杭白芍中芍药苷含量(%)
|采样季度|根(%)|茎(%)|
|一季度|1.11±0.33|——|
|二季度|1.41±0.15|0.68±0.17|
|三季度|1.48±0.26|1.24±0.11|
|四季度|1.51±0.29|——|
目前白芍的采收均在农历八月中旬到九月中旬，此时白芍中的芍药苷含量的积累仍呈增加趋势，药材仍有较高水平的折干率，同时鲜药材中芍药苷类成分的产量也高，说明传统采收时间合理。相关研究表明杭白芍最佳采收期以农历八月下旬至十月上旬比较适宜，与本文研究结果一致;另有研究表明杭白芍芍药苷主要富集于根茎(芍头)，远高于主根，须根中含量也较主根更高，亦符合本文研究结果。
(三)杭白芍活性成分变化与土壤菌群的联系
相关研究表明，真菌的丰度不随杭白芍种植年限发生显著变化，但多样性会随生长而增加;杭白芍根系土壤中的优势细菌为γ变形菌、α变形菌、放线菌、酸杆菌及厚壁菌等，根系土壤细菌多样性为三年生>四年生>二年生>一年生，且明显高于非根际土，表明根系土壤菌群多样性整体随年限的延长而上升。结合本文桐庐杭白芍根的总皂苷、芍药苷含量也逐年上升，且总皂苷每年增加量第三年>第二年>第四年，芍药苷每年增加量第三年>第四年>第二年，推测桐庐杭白芍根活性成分的提高可能与土壤菌群的活动有关。
另有研究表明，土壤菌群的数量及种类有季节性的波动，春季和夏季温度升高、降雨量变多、微生物活动增多，菌群数量和多样性达到高峰;秋季和冬季温度降低、降雨量减少则相反。这与本文桐庐杭白芍根的总皂苷、芍药苷含量变化一致，其于第二季度增长量最多，此时正值春夏生长期，菌群活动活跃;而次年第一季度含量反而降低，原因可能是冬季土壤菌群活动缓慢，同时部分有效成分被作为营养物质分解代谢。
此外，土壤pH影响微生物群落的生长，芍药苷含量与土壤pH呈显著的正相关性，四年间杭白芍生长的土壤pH约在5.12，土壤pH会随种植年限增长而提高;桐庐土壤为微酸性，pH均值为5.53，与杭白芍生长的土壤环境相符。
综上所述，本实验研究了一年生至四年生桐庐杭白芍中总皂苷和芍药苷的含量变化以及二年生杭白芍不同季节中总芍药苷和单体芍药苷的含量变化，同时对白芍茎中的活性成分也进行了初步测定，讨论了杭白芍活性成分变化与土壤菌群间的关系，为白芍综合开发利用提供了技术支持，其他组织器官中活性成分及其含量与土壤菌群间的关系有待进一步深入挖掘。
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