摘 要：为明确生物有机肥不同施入量对苹果幼苗长势及根际土壤微生物功能多样性的影响，以1年生 ‘烟富8号’苹果幼苗为试验材料，采用盆栽试验，设置4个处理，即鸡粪CK[35 g/(kg·土)]、生物有机肥 T1[23.3 g/(kg·土)]、T2[35 g/(kg·土)]及T3[70 g/(kg·土)]。结果表明，生物有机肥增加苹果幼苗株高和根长，其中生物有机肥23.3 g/(kg·土)处理下，较CK分别显著增加14.24%和24.02%，且与其他处理差异显著。生物有机肥可增加苹果幼苗抗逆指标和促进养分吸收，生物有机肥23.3 g/(kg·土)处理下，苹果幼苗叶片脯氨酸含量、叶绿素SPAD值和钾含量较CK分别显著提高38.46%、15.45%和27.33%，丙二醛含量显著降低。生物有机肥70 g/(kg·土)处理的土壤微生物多样性指数H'、丰富度指数S、均一性指数U和土壤微生物对碳水化合物、胺类利用强度最高，较CK分别提高0.91%、7.60%、4.14%、6.33%和18.92%，且与23.3 g/(kg·土)处理差异不显著。综合因子主成分分析，生物有机肥23.3 g/(kg·土)处理得分最高。因此，生物有机肥能够促进苹果幼苗生长，提高抗逆性、养分吸收、土壤微生物功能多样性以及对碳源的利用强度，其中以生物有机肥23.3 g/(kg·土)处理效果最佳。
关键词：生物有机肥;苹果幼苗;生理特性;土壤微生物功能多样性
0 引言
生物有机肥含有功能菌，功能菌的快速繁殖可优化土壤微生物种群结构，增强土壤酶活性，活化土壤养分[1] ，提高根系活力[2] ，促进根系对营养元素的吸收利用[3] ，提高作物产量和品质[4- 5] ，增强作物抗病和抗逆性[6-7] 。如曹亮亮等[8] 发现在腐熟鸡粪堆肥中添加2种蛋白原料固态发酵根际功能菌研制成的生物有机肥，均能显著增加盆栽香蕉植株的株高和假茎粗。陈波等[9] 研究表明，生物有机肥较对照及有机肥处理，显著促进了盆栽樱桃树体对氮、磷、钾的吸收。艾尔买克· 才卡斯木等[10] 通过盆栽试验发现，不同氯化钠浓度胁迫下，实生核桃幼苗接种EM菌，核桃幼苗生物量和超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性均显著高于非菌根植株，而叶片丙二醛(MAD)含量显著低于非菌根植株。同时邵丽等[11] 采用Biolog-Eco法研究表明，生物复混肥能显著提高土壤微生物群落碳源利用率、微生物群落丰富度和功能多样性。孙薇等[12] 利用 Biolog-Eco技术分析了不同施肥处理对土壤微生物群落代谢能力的影响，结果表明，生物有机肥处理土壤微生物活性、物种多样性、丰富度以及对6类碳源代谢能力均显著高于常规施肥。然而生物有机肥在促进盆栽苹果幼苗生长、抗逆指标以及对土壤微生物多样性影响的有关报道仍较少。
本研究以1年生苹果幼苗‘烟富8号’为试材，以常规有机肥鸡粪为对照，研究生物有机肥不同施用量对苹果幼苗生长、生理特性以及土壤微生物功能多样性的影响，确定其在树苗栽培中最佳施用量，以期为生物有机肥在苗木培育中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验地基本情况
试验于2017年4月在中国农业科学院郑州果树研究所试验田进行。区域气候为温带大陆性季风气候，年平均降雨量 632 mm，无霜期 220 天，全年日照时间约2400 h。
1.2 供试材料
供试作物为1年生苹果幼苗‘烟富8号’。
供试肥料包括生物有机肥(有效活菌数≥2亿个/g，有机质≥70%，氨基酸≥20%，腐殖质≥40%，N+P2O5+ K2O≥6%)和鸡粪(有机质≥50%，N+P2O5+K2O≥6%)。
1.3 试验设计
试验以盆栽方式进行，采用内径 31 cm、高 38 cm 的圆筒塑料盆，每盆装风干土20 kg。试验共设4个处理，CK为鸡粪35 g/(kg·土)，T1、T2、T3分别为生物有机肥23.3、35、70 g/(kg·土)，其中，23.3、35、70 g/(kg·土) 指供试肥料中折算出有机含量与土壤质量比值，每处理重复3次，每重复种植4盆，完全随机排列。各处理中土壤与有机肥充分混匀后装盆备用。
1.4 样品采集及测定
1.4.1 株高样品选择 9 月收获时，每处理每重复选择生长一致的‘烟富8号’苹果幼树进行测定。
1.4.2 叶片样品采集 9月收获时，每株采取枝条倒2~4 片叶，一部分叶片带回实验室立即测定鲜重、叶面积、叶片 SPAD 值，后烘干粉碎用于测定叶片中氮磷钾含量;一部分叶片用冰盒带回实验室并保存于4℃冰箱中用于测定叶片抗性物质和酶活性等指标。
1.4.3 土壤样品采集 每处理每重复选择4株树以抖落法[13] 采集果树根际土壤样品，去除植物残根等杂物后，并将4个土样混合，过2 mm孔径的无菌筛网，-80℃储存。
1.4.4 根系样品采集 将去除土壤的根系放于0.149 mm 的筛中，用水冲洗干净，取出杂物、死根后，将根系用吸水纸吸干后保存，用于测定根系的各项指标。
1.4.5 样品测定 株高用直尺测量植株从露出土壤根部至顶端的距离，叶面积采用便携式叶面积仪CI-203CA 测定，主根长采用直尺测定，根体积采用排水法测定[14] ，叶片SPAD值采用SPAD-502仪测定，叶片可溶性糖采用蒽酮比色法测定[15] ，叶片可溶性蛋白采用考马斯亮蓝 G-250 染色法测定[15] ，叶片丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定[14] ，叶片脯氨酸采用磺基水杨酸法测定[14] ，叶片POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)和 PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性方法参见文献 [16]，采用H2SO4和H2O2消煮，全自动间断化学分析仪(Clever Chem 380，德国)测定叶片氮和磷含量，火焰光度计测定叶片钾含量[17] 。
1.4.6 土壤微生物群落测定 将相当于1 g烘干土的新鲜土壤加入到盛有99 mL 0.85%灭菌生理盐水的250 mL 三角瓶中，28℃、200 r/min条件下振荡培养30 min，使土样与生理盐水充分混匀，再放置在 4℃冰箱内静置 30 min，然后加样于Biolog-Eco板微孔板中，每孔加入 150 μL。25℃下培养192 h，每24 h Biolog自动读取仪读数 1 次(Biolog MicroStation 自动微生物鉴定 ，美国)。Biolog-ECO 96 孔微平板上分布 31 种单一碳源和空白对照，每种碳源和空白有3个平行。31种单一碳源大致可分为6类(碳水化合物、氨基酸类、羧酸类化合物、聚合物、胺类化合物和酚酸类化合物)，并以各类碳源在96 h的相对光密度(Ci-R)平均值表示土壤微生物对这一碳源的利用强度。一个板可以测3个平行。
1.5 数据整理与分析
采 用 Microsoft Excel 2010 进 行 数 据 处 理 ;用 SPSS 17.0统计软件进行方差分析，对苹果幼苗生物量(株高、叶面积、百叶鲜重、根体积、根长)、叶片生理特性(丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸、过氧化物酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸解氨酶、SPAD 值、叶片氮、磷、钾)、土壤微生物群落多样性指数(均匀度指数、优势度指数、多样性指数、丰富度指数、均一性指数)、土壤微生物对 6 类碳源的利用强度(聚合物、碳水化合物、酚酸类化合物、羧酸类、氨基酸类、胺类)用 SPSS 17.0统计软件进行主成分分析。分析中，一般选择特征值大于1的成分作为主成分。本研究数据分析中，特征值大于1的有3个成分，分别记作F1、F2、F3。这3 个主成分的累计贡献率为100.00%，表示这3个主成分涵盖了所有的原始数据信息。每个处理的综合得分按照式(6)计算。
2 结果与分析
2.1 生物有机肥对苹果苗生物量的影响
如表1所示，与CK相比，生物有机肥处理增加苹果苗株高和根长，其中，T1处理的株高和根长最高，较 CK分别显著增加14.24%和24.02%，且T1处理与其他处理差异显著。生物有机肥处理的苹果幼苗叶面积和百叶鲜重均低于CK，其中T3处理的叶面积和百叶鲜重最低，较 CK 分别显著降低 12.78%和 23.85%，其他处理与CK差异不显著。除T1处理外，生物有机肥处理的苹果幼苗根体积均显著低于CK。
2.2 生物有机肥对苹果叶片生理特性的影响
2.2.1 生物有机肥对苹果叶片抗性物质的影响 由表2可以看出，施用不同浓度生物有机肥对苹果叶片抗逆性指标影响各异。与CK相比，T1处理的苹果叶片可溶性糖和脯氨酸含量最高，丙二醛含量最低，除可溶性糖外，差异达显著性水平。生物有机肥处理的苹果叶片可溶性蛋白含量均低于CK，其中T1和T3处理叶片可溶性蛋白较CK分别显著降低19.65%和26.39%。
2.2.2 生物有机肥对苹果叶片酶活性和 SPAD 值的影响 由图1可知，T1处理下，苹果叶片过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性达最高，较 CK 分别增加 5.84%和 5.48%，差异不显著;与CK相比，T2处理显著提高苹果叶片过氧化氢酶活性，其他处理与CK无显著差异;T3 时处理下，苹果叶片过氧化物酶、过氧化氢和苯丙氨酸解氨酶活性达最低。由此表明，低用量生物有机肥可促进叶片酶活性，高用量抑制叶片酶活性。苹果叶片 SPAD 值由高到低依次为 T1>T2>T3>CK，其中，T1 和 T2处理苹果叶片SPAD值较CK分别显著提高15.45% 和12.71%，T3处理与CK差异不显著。
2.2.3 生物有机肥对苹果叶片氮、磷、钾含量的影响 生物有机肥对苹果叶片氮、磷、钾含量的影响如图2。结果表明，T1和T3处理苹果叶片氮含量较CK分别增加 2.58%和7.79%。同时生物有机肥显著提高苹果叶片钾含量，钾含量由高到低依次为T1>T2>T3>CK，T1处理较 CK 显著增加 27.33%，不同处理间差异不显著。但生物有机肥处理对苹果叶片磷含量影响不大。
2.3 生物有机肥对苹果土壤微生物多样性的影响
2.3.1 不同处理土壤微生物功能多样性指数分析 选取土样培养96 h数据进行土壤微生物代谢多样性分析，不同施肥处理对苹果土壤微生物群落功能多样性指数影响不同，如表3所示。T2处理的土壤优势度指数D、多样性指数H'和丰富度指数S显著低于其他处理，T3 处理的多样性指数 H'、丰富度指数 S 和均一性指数 U 最高，较CK分别提高0.91%、7.60%和4.14%，且与T1 处理差异不显著。
2.3.2 不同处理土壤微生物对6类碳源的利用强度 由图 3 可知，施生物有机肥与鸡粪 CK 土壤微生物对 T1处理土壤微生物对酚酸类化合物和胺类利用强度较CK分别增加18.87%和13.51%，且与其他处理无显著性差异;T3处理土壤微生物对聚合物、碳水化合物、氨基酸类和胺类利用强度最高 ，较 CK 分别增加 20.00%、6.33%、16.88%和18.92%;与CK相比，T2处理土壤微生物对聚合物、碳水化合物和羧酸类利用强度分别降低8.33%、8.86%和21.79%。
2.4 不同处理对苹果幼苗生长、土壤微生物多样性指数、碳源利用强度综合影响主成分分析
通过主成分分析(表4)可知，第1主成分其特征值的变量解释度为45.345%，是最主要的解释变量，前2 个成分的特征值为79.196%，表明这2个成分是主要分析部分。对各处理在3个成分中进行综合评价(表5)， T1得分最高，为2.06，说明T1处理苹果土壤微生物功能多样性指数、碳源利用强度及苹果苗生物量、叶片抗性物质、酶活性、SPAD值、养分含量最高。Biolog-Eco板中不同类碳源利用强度存在不同差异。
3 结论
施用生物菌肥可不同程度上增加苹果幼苗株高、根长、叶片钾养分、可溶性糖和脯氨酸含量，影响叶片酶活性，改善土壤微生物功能多样性，其中以施用 23.3 g/(kg·土)生物有机肥的效果最好。施用生物有机肥23.3 g/(kg·土)显著提高苹果苗株高、根长和叶片钾养分、脯氨酸和 SPAD 值，增加叶片酶活性，促进苹果苗生长，施用70 g/(kg·土)生物有机肥反而降低叶片酶的活性;同时，施用 23.3 g/(kg·土)生物有机肥增加土壤微生物群落丰富度，提高土壤微生物对酚酸类化合物和胺类利用强度。
4 讨论
4.1 生物有机肥对苹果幼苗生物量和养分含量的影响
生物有机肥含有溶磷、固氮功能的有益微生物，能够改善土壤环境，促进作物生长发育[19] 。李北齐[20] 研究发现，施用生物有机肥能增加盆栽盐碱土玉米的株高和根长。本研究与其类似，施用生物有机肥均能促进苹果幼苗的株高和根长，其中生物有机肥23.3 g/(kg·土)处理(T1)效果最佳。生物有机肥用量为70 g/(kg·土)处理 (T3)对苹果幼苗叶面积、百叶鲜重以及根体积产生抑制作用。可能是由于生物有机肥用量过多，其成分抑制或导致其他元素供应不足，从而抑制苹果幼苗生长[21] 。同时本研究发现，生物有机肥可提高苹果叶片氮和钾含量，这与张金妹等[22] 的研究结果相似。生物有机肥中的有益微生物菌群具有固氮解钾能力，使土壤养分有效地供应给作物，从而提高氮、钾含量[23] 。
4.2 生物有机肥对苹果叶片生理特性的影响
丙二醛是植物在逆境环境下细胞发生膜脂过氧化作用的产物之一，其含量反映植物遭受逆境的伤害程度[24] 。本试验结果表明，与鸡粪CK相比，施用生物有机肥能够显著降低苹果叶片丙二醛含量，即降低苹果叶片膜脂质过氧化程度，预防并修护叶片细胞和细胞膜损伤，增强植株生长代谢活力，这与刘艳等[25] 的研究结果相似。脯氨酸是植物体内一种细胞质渗透调节物质，植物在逆境环境下体内脯氨酸含量发生改变[25] 。本研究发现，生物有机肥低浓度23.3 g/(kg·土)处理叶片脯氨酸含量显著高于高浓度70 g/(kg·土)处理，可能是高浓度生物有机肥胁迫下细胞受害严重，导致叶片脯氨酸含量减少[26] 。植物体内防御酶活性与植物抗性相关，生物有机肥增强草莓抗逆性[27] 。本研究表明，生物有机肥能提高叶片过氧化氢酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶 (PAL)活性，增强幼苗抗逆性，这与谢东锋等[28] 研究结果相似。同时发现，生物有机肥低浓度23.3 g/(kg·土)处理时3种酶活性增加，高浓度时70 g/(kg·土)处理酶活性降低，这可能与处理叶片丙二醛含量有关(表2)，即丙二醛含量降低，酶活性增加，丙二醛含量的积累对酶活性增加具有诱导作用[29] 。
4.3 生物有机肥对土壤微生物多样性的影响
笔者用Biolog-Eco方法研究了施用生物有机肥对土壤中微生物群落代谢的影响，结果表明，施用生物有机肥平均能增加土壤微生物多样性指数以及微生物对6类碳源的利用强度，可能是生物有机肥的施用改善了土壤水分、营养、通气等环境条件，为土壤微生物提供良好的生长环境，提高了土壤微生物代谢能力，增强了土壤微生物竞争能力，从而提高土壤微生物功能多样性以及对6类碳源的利用能力[30-31] ，具体作用机理有待进一步研究。——论文作者：于会丽1 ，徐变变1 ，徐国益1 ，邵 微1,2 ，高登涛1 ，司 鹏1
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