摘 要：蛋白质组学是一门全方位研究生命结构功能、生理功能及生命活动规律的新兴学科，已成为后基因组时代研究的重要内容，在很多领域得到广泛关注，同时为畜牧科学的发展与创新提供了全新的研究思路和技术手段。目前，蛋白质组学在畜禽生长发育、繁殖、营养、疾病、肉质等方面均有涉及，并通过各种研究手段发掘出一批与畜禽重要经济性状相关的蛋白质，对生产有重要的理论指导意义。蛋白质翻译后修饰(post-translationmodifications，PTMs)作为蛋白质组学研究的一个重要分支，在增加蛋白质多样性和进行复杂生理学调控过程中发挥着重要的作用，能更好地揭示生命现象的本质与规律。作者对蛋白质组学及PTMs在畜牧领域中的应用研究进展进行了综述。
关键词：蛋白质组学;畜牧;蛋白质翻译后修饰(PTMs)
人类基因组计划完成后，生物学被重新划分为前基因组和后基因组。前基因组时代是对结构基因组学进行研究，而后基因组时代主要是对功能基因组和蛋白质组进行研究。1995年，Swinbanks[1]首次报道了 Wilkins和 Williams提出的蛋白质组概念。蛋白质组(proteome)源于蛋白质(protein)和基因组(genome)，指基因组表达的所有蛋白质，包括一种细胞或一个生命个体表达的全部蛋白质[2]。在后基因组时代，蛋白质组学已成为生命科学研究的重要内容。1941年，Beadle和 Tatum 提出了“一个基因对应表达一个蛋白质”的假说，但实际上一个基因可以表 达 多 种 蛋 白，如 人 的 一 个 基 因 约 可 编 辑10种蛋白 质[3]。这 表 明 基 因 组 计 划 存 在 局 限 性，mRNA 也不能完全反映蛋白质的质量和数量。如果基因是遗传信息的源头，那么蛋白质则是基因功能的执行者，也是生命活动的直接体现者，因此，蛋白质组学研究可以更好地揭示生命现象的本质与规律。与基因组相比，蛋白质组更加复杂，更具有多样性、动态性和挑战性。目前，蛋白质组学已在很多研究领域中得到广泛关注，在畜禽生长发育、营养、疾病、繁殖及肉质等方面也已经开展蛋白质组学研究，不仅为畜牧科学研究提供了新思路、新技术和新方法，而且也为畜禽生产提供了借鉴和指导。
随着测序技术和生物信息学的发展，蛋白质组学研究也迅速渗透到畜牧领域并发挥重要的作用。后基因组时代关注对复杂表型的研究，而选择性剪接[4]和蛋白质翻译后修饰(post-translationmodifi-cations，PTMs)是 造 成 蛋 白 质 复 杂 性 的 主 要 原因[5]。PTMs作为蛋白质组学的重要研究内容，逐渐成为后基因组时代新的研究趋势。PTMs是蛋白质组学研究的延伸，也是有限数量的基因在生物体中调控复杂生理过程的重要前提[6]。蛋白质组和PTMs的结合研究必将成为未来畜牧领域研究的新热点。
1 蛋白质组学概述
蛋白质组学有两种研究策略：“完全”蛋白质组学研究策略和“差异”蛋白质组学研究策略[7]。研究内容可分为5个方面：①表达定量蛋白质组学：利用双向凝 胶 电 泳 (two-dimensionalgelelectrophore-sis，2-DE)、多 维 高 效 液 相 色 谱 (multidimensionalhigh performance liquid chromatography，MH-PLC)、生物质谱等蛋白质鉴定分离方法对特定细胞、组织或器官的蛋白质进行表达定量;②结构蛋白质组学：主要利用化学降解、质谱等方法对蛋白质进行氨基酸序列组成、数量、二级结构及空间立体结构的研究;③修饰蛋白质组学：通过对相应的共价键修饰基团进行同位素标记来实现 PTMs及蛋白质加工的分析和鉴定;④功能蛋白质组学：对特定功能、阶段的蛋白质进行亚细胞定位，并对其生物功能及作用机理进行研究;⑤互作蛋白质组学：通过建立蛋白质互作模型对蛋白质与蛋白质、蛋白质与小核酸分子之间的作用机制和遗传关系进行研究[8-9]。
2 蛋白质组学研究技术与方法
蛋白质组学技术的一般流程是：蛋白质样品制备、质谱绘制、质谱数据分析和蛋白质鉴定。现阶段蛋白质组学常用技术有2-DE 蛋白质分离技术、质谱蛋白质鉴定技术和蛋白质生物信息学技术。
2.1 双向凝胶电泳技术
1975年，O’Farrell[10]发明了2-DE蛋白质分离技术，因其高分辨率、高灵敏度的特点使其成为检测分析复杂蛋白质的有力工具，并广泛应用至今。该技术利用蛋白质等电点和分子质量进行二维分离，一维分离是利用十二烷基硫酸钠电泳进行的蛋白质分离，二维分离是基于等电聚焦电泳进行的蛋白质分离。等电聚焦(immobilizedpHgradient，IPG)技术[11]的出现使2-DE 技术得到完善，但也存在一定的问题，2000年，Gigi等[12]发现蛋白质高表达水平限制了2-DE质谱法对中、低丰度蛋白质的分析，在蛋白质组分析中同样受到限制。双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)是2-DE 蛋白质分离技术的突破，两个蛋白质样品可在同一凝胶上进行差异检测，大大提高了分离效率，且简化了2-DE 的复杂过程，具有重复性好、灵敏度高的优点[13]。
2.2 质谱技术在蛋白质组学中的应用
2.2.1 质谱技术 质谱是依据蛋白质分子气相质量比(m/z)进行蛋白质分析鉴定的一种技术。质谱仪一般由离子源、质量分析仪和检测器组成，蛋白质或多肽在离子源处电离，再经过质量分析仪得出质谱图，最后进入检测器检测分析。因为质谱技术能为蛋白质多肽分析鉴定、蛋白质序列分析鉴定和蛋白质修饰差异分析鉴定提供数据支持，所以质谱技术是复杂蛋白质组分析与鉴定的基础。目前，离子源进行离子电离的方法主要有电喷雾电离(elec-trosprayionization，ESI)[14]和基质辅助激光解吸/电离 (matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)[15]两种，用于蛋白分子 m/z的质量分析仪主要有飞行时间(TOF)、四极杆、离子阱(orbitrap)、轨道器和傅立叶变换(FT)离子回旋共振5种，应用到生物大分子鉴定、定量的主要有高分辨率三重四极杆(QQQ)、高分辨率飞行管和超高分辨静电场Orbitrap3种[16-18]。QQQ 能在不同条件下完成多种功能的串联质谱(MS/MS)分析，这种方法可确定离子归属、探究离子碎裂途径、分析化合物结构和定量蛋白质;高分辨率飞行管采用离子延迟引出和反射器技术具有分辨率高、准确度高的特点;超高分辨静电场 Orbitrap质量分析仪分辨率高、灵敏度强，不仅能实现全扫描，还可以利用离子存储技术选择任意质量 离 子 进 一 步 断 裂，实 现 二 级 或 多 级 质 谱(MSn)分析[19]。离子源与质量分析仪的联合应用极大地提高了质谱检测率和分辨率，并为质谱技术在蛋白质组学中的应用与发展奠定了基础。
2.2.2 蛋白质质谱鉴定 肽质量指纹谱(pep-tidemassfingerprint，PMF)和 MS/MS是复杂蛋白质鉴定和分析的重要技术。PMF 是胰蛋白酶水解后的蛋白质多肽图谱[20]，通常与基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱联合应用进行蛋白质鉴定。这种技术具有通量高、盐离子耐受性好的特点，但对于肽段多态性和肽段质量冗余(pep-tidemassredundancy)的鉴定存在一定错误[21]。利用 MS/MS技术鉴定蛋白质时被水解的蛋白质电离后需要经过两个阶段：第一个阶段是在质谱仪中进行 m/z分析;第二个阶段是在碰撞室中将离子片段分离成多肽片段，最后将得到的片段数据与多肽片段数据 库、核 酸 数 据 库 进 行 比 较[22]。值 得 注 意 的是，用于蛋白质鉴定的多肽片段具有特异性，因此，蛋白质质谱鉴定必须使用纯化样品[23]。
2.2.3 蛋白质质谱分析方法 目前，蛋白质质谱分析鉴定主要有两种方法：一种是自上而下(Top-down)的方法;另一种是自下而上(Bottom-up)的方法(图1)。Top-down是基于凝胶电泳系统原理的蛋白质分析鉴定方法，Bottom-up是基于鸟枪法的蛋白质分析鉴定方法[24]。Top-down是将完整蛋白质进行2-DE 或2D-DIGE，筛选出目标蛋白质并将其在胶内进行水解后进行质谱分析;Bottom-up是将多种复杂蛋白质用一种蛋白酶水解成多肽或氨基酸后再进行色谱串联质谱(LC/MS/MS)分析。
两种方法各有优缺点，Top-down比 Bottom-up更具有深入研究蛋白质的潜力，Top-down能够对整个蛋白质或小分子多肽进行整体结构分析，并能为PTMs的潜在叠加修饰鉴定提供数据支持。Bot-tom-up是 先 将 混 合 蛋 白 质 进 行 水 解 再 进 行 LC/MS/MS分析，此方法不能保证蛋白质的完整性，且在定量蛋白质时也不能区分潜在的叠加蛋白质修饰，所以 Top-down在单一蛋白质整体结构、序列组成和精准修饰的分析鉴定上具有优势，而 Bottom-up在灵敏度和蛋白质样品多样性上具有优势。在数据方面，Bottom-up可以在短时间内得到大量的数据，但由于蛋白质数据库、算法和通量的限制使蛋白质的分析与处理成为挑战[19，25]。
2.2.4 蛋白质质谱定量 基因组或复杂体系表达的所有蛋白质进行精确定量和鉴定的蛋白质组学称为定量蛋白质组学[26]。定量蛋白质组学主要利用蛋白质定量技术和质谱技术分析鉴定蛋白质组成、修饰、变异及差异表达。蛋白质定量技术主要分为三大类：一 是 用 于 体 内 动 物 细 胞 蛋 白 质 定 量 的SILAC(stableisotopelabelingbyaminoacidsincell)定量法;二是体外同位素标记蛋白质定量法，包括相对绝对定量法(iTRAQ)、串联质量标记 TMT(tandem masstags)定量法、同位素编码亲和标记ICAT(isotope-codedaffinitytags)定量法;三是非标记(Label-free)定量法，这些技术都可以对蛋白质进行 Top-down整体蛋白质定量[27-32]。稳定同位素标记蛋白质定量技术极大地推动了定量蛋白质组学的发展，可依据不同应用范围、样品、试验方案、分析鉴定目的和价格等选择最适蛋白质定量法，SILAC蛋白质定量法是一种利用同位素标记体内或细胞中合成的氨基酸从而实现目标蛋白质定量的方法[33]。与ICAT 蛋白质定量法相比，iTRAQ 是基于 LC/MS/MS的新一代蛋白质定量法，其灵敏度和通量更高[34]。而 TMT 蛋白质定量法比iTRAQ 在通量和同位素标记数量上更具优势，可以平行标记定量更多的蛋白质。Label-free蛋白质定量方法与上述同位素标记法不同，它不使用昂贵的同位素标签作为内部标准，而是在质谱分析时使用蛋白质水解肽分解肽段，此种方法克服了传统同位素法的缺点，能快速、简便地获得高浓度复杂蛋白质样品的定量结果。但 Label-free蛋白质定量法对样品分别进行蛋白质定量的方式会增大试验误差，且全球蛋白质数据库还 不 完 善，使 其 数 据 分 析 受 到 了 限 制。对 于TMT 蛋白质定量法，Hung等[32]利用 Top-down整体蛋白质定量方法和 TMT 蛋白质定量技术对蛋白质定量进行了研究，这种研究策略为蛋白质组学进一步发展奠定了基础，也为实现更加直接、准确和多重的蛋白质定量分析提供了基础。
2.3 蛋白质组学生物信息学分析
随着蛋白质组学研究技术和方法的不断优化，蛋白质组学高通量数据分析显得尤为重要，特别是蛋白质组 学 数 据 库 的 建 立 与 生 物 信 息 学 的 应 用。SwissProt、TrEMBL和 UniPort是公认的重要的蛋白质 数 据 库，收 录 了 所 有 已 知 蛋 白 的 具 体 信 息，NCBInr收录了公共数据库中几乎所有的蛋白质序列，这些数据库为蛋白质组学高通量分析提供了大量的信息基础。生物信息学不仅为蛋白质组学的深入研究奠定了基础，同时也为候选蛋白质结构分析、功能预测及相关生物学通路分析提供了技术支持。ExPASy、SOPMA、GOR、SWISS-MODEL、CPH-models等软 件 和 数 据 库 常 用 于 蛋 白 质 结 构 分 析;GO、KEGG 等数据库则主要用于蛋白质相关富集通路筛选及分析[35]。
3 蛋白质组学在畜牧相关领域中的应用
目前，在畜禽生长发育、繁殖、营养、疾病、肉质等方面利用蛋白质组学技术挖掘重要经济性状差异蛋白和调控因子的研究屡见不鲜，其研究成果对畜牧科学和畜禽生产有重要的指导意义。
3.1 畜禽生长发育及肉品质研究
动物骨骼肌生长发育是畜禽遗传育种的重要研究内容，遗传、肌肉组织学特性、饲养过程、屠宰和运输操作等因素都对畜禽生长发育及肉品质造成影响[36]。蛋白质是畜禽肌肉的重要组成成分，是动物生命活动的直接体现者，因此进行蛋白质组学研究可以打破在 DNA 或 RNA 水平上的局限性，从而揭示生命活动的本质规律。骨骼肌肌纤维数量和横截面积直接影响骨骼肌的生长发育，而肌纤维又因畜禽品种、性别和年龄各异[37]。牛、羊肌肉模型是研究畜禽肌肉生长发育[38]的一般方法，而蛋白质组学技术能更准确地阐明骨骼肌生长发育的机理。在鸡上，Doherty等[39]利用2-DE技术对孵化后1～27d特 定 时 间 内 鸡 的 肌 肉 蛋 白 进 行 分 离，再 利 用MALDI-TOF质谱研究肉鸡在快速生长状态下肌肉蛋白质的动态变化情况，最终发现90个蛋白质，其中51个与鸡生长发育蛋白质相匹配，且在鸡发育27d以上的肌肉中有显著变化。这种筛选与骨骼肌生长发育相关的蛋白质的研究思路在中国本土迷你型猪中也有研究，Wang等[40]对2个不同品种的6月龄中国本土迷你型猪背最长肌进行蛋白质组学分析，通过与2个西方引进品种进行比较，最终发现了与猪肌肉生长、脂肪沉积相关的关键蛋白和调控肌纤维 生 长、脂 质 沉 积 能 力 的 关 键 基 因。Bouley等[41]在正常肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)缺失情况下利用蛋白质组学技术对纯合子和杂合子青年比利时蓝公牛肌肉差异蛋白质组进行了分析，结果发现有13种蛋白质对肌钙蛋白 T 的 mRNA 剪接体及其互相排斥的外显子16的结构有显著影响。Ferreira等[42]使用 Label-free蛋白质定量法研究肉用绵羊 在 季 节 性 体 重 下 降 (seasonalweightloss，SWL)状态下肌肉蛋白质组的变化，比较了澳大利亚美利奴羊(SWL 敏感型)、Damara羊(SWL 耐受型)和 Dorper羊(SWL中间耐受性)的耐受性，并在营养限制条件下建立了不同品种假设标记，结果证明美利奴羊的过氧化氢酶含量与SWL显著相关。
屠宰性状也是衡量畜禽肉品质的重要指标，畜禽屠宰后肌肉代谢过程中的生物化学指标、组织化学特性是影响肉品质的关键因素[43]。蛋白质是肌肉代谢过程中的最佳体现者，因此，蛋白质组学是研究畜 禽 肌 肉 代 谢 及 肉 品 质 的 重 要 方 法。贾 建 磊等[44]利用差异蛋白质组学对生鲜和冷藏青藏高原有机牦牛背最长肌进行了蛋白质定量研究，结果显示，生鲜肉与冷藏肉有7个显著差异表达的蛋白，其中2个上调、5个下调。2007年，Park等[45]进行了长白猪和韩国本地黑猪(KNP)背最长肌纤维类型、屠宰后水解代谢的研究，最终发现肌球蛋白轻链同型v/sb、脂肪酸结合蛋白和白蛋白在 KNP中高水平表达，而不同亚型的肌动蛋白在老化过程中表现出不同的降解趋势。在鸡肌肉品质试验中，Molette等[46]对火鸡胸肌肉品质和蛋白质变化进行了深入的研究，最 终 也 发 现 了 影 响 鸡 肌 肉 品 质 的 调 控 蛋白质。
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利用蛋白质组学技术还可以预测与肌肉嫩度相关的靶标蛋白质，从而帮助改善肉品质。Lametsch等[47]研究了肌原纤维与钙激活中性蛋白酶对猪肉嫩度的联合作用，并对钙激活蛋白酶介导的特异性肌原纤维蛋白降解进行了分析，发现猪死亡后肌肉组织中钙蛋白酶导致的肌动蛋白和肌球蛋白重链降解是猪肉嫩度变化的主要影响因素。Taylor等[48]发现钙激活中性蛋白酶对屠宰后肉嫩度起着关键作用，肌肉交接点首尾相连处的 Z-disk退化也是影响因素之一[49-50]。肌肉的发达程度和硬度也与肉嫩度相关，如双肌臀绵羊(Callipygesheep)，因 Callipyge基因突变导致臀部肌肉异常发达，肉硬且体尺大，有研究发现屠宰后的肌肉钙激活中性蛋白酶水平较低，肌肉的结构变化慢[51]，因此也再次证明了钙激活中性蛋白酶在调控肌肉嫩度上发挥关键作用。除了肌 肉 嫩 度，肌 肉 系 水 力 也 影 响 肉 品 质，VanLaack[52]指出 PSE(palesoftexudative)肉的形成是由于肌浆蛋白变性和肉持水能力降低导致的，并说明了肌浆蛋白和肌肉系水能力之间的相关性。Pen-ny[53]研究发现，肌原纤维系水能力的大小主要由肌原纤维蛋白的变性程度决定，足以看出蛋白质组学技术及方法对畜禽生长发育及肉品质研究的重要性。
3.2 畜禽繁殖相关研究
畜禽繁殖效率直接影响生产效益，而繁殖性能又受到遗传因素的影响，蛋白质组学研究能够从蛋白质层面揭示畜禽繁殖机理。2017年，Lin等[54]利用iTRAQ 技术研究了超数排卵后母羊颗粒细胞变化对卵母细胞存活率的影响，对6个与卵母细胞存活率显著相关的蛋白(MAPK1、SMAD2、SMAD4、CDK1、FOS和 ATM)进行了差异蛋白和通路注释分析，发现它们都存在于与卵子存活率相关的通路中，随后对母羊卵泡发育的分子机制进行了深入研究，揭示了超数排卵后母羊卵子存活率变化的机制。Miao等[55]对小尾寒羊卵巢进行蛋白质组学研究，进一步揭示了小尾寒羊多羔性状的可能分子机制。蛋白质组学技术为进一步筛选标记蛋白、调控因子和揭示繁殖规律提供了理论基础，开展雄性睾丸及精子的蛋白质组学研究是挖掘和探索雄性畜禽繁殖潜能的重要手段。Sun等[56]通过比较不同发育阶段的精子蛋白质差异，挖掘影响牛、牦牛杂交雄性不育的关键差异蛋白质，最终发现了可能与睾丸发育和精子发生有关的候选蛋白。薛夫光[57]比较了正常公鸡和低繁殖力公鸡睾丸发育情况和形态特征，并采用iTRAQ 技术检测睾丸组织中的差异蛋 白质，通过生物信息学分析筛选出与生殖力相关的候选蛋白，该试验结果为进一步研究影响公鸡生殖能力和睾丸发育的分子遗传机制提供了条件。由此可见，蛋白质组学在畜禽繁殖方面的深入研究与应用可以进一步阐明畜禽繁殖机理，提高畜禽繁殖性能。
3.3 乳、蛋及羊毛畜牧副产品相关研究
乳类和蛋类是人们重要的蛋白质来源，乳中富含酪蛋 白 (CN)、乳 清 蛋 白 (WP)和 乳 脂 球 膜 蛋 白(MFGM)等乳蛋白，其含量及多样性决定了乳制品的品质。利用蛋白质组学技术可以研究复杂乳成分，检测乳品质[58-59]。Yang等[60]通过iTRAQ 技术研究牛、牦牛、水牛、山羊和骆驼奶中的乳清蛋白标记，成功筛选到一批作为定量不同物种乳清蛋白的模式标记蛋白。该团队还利用iTRAQ 蛋白质定量技术对荷斯坦牛、泽西岛牦牛、水牛、山羊、骆驼、马和人的 MFGM 富集蛋白质组进行了分析，最终阐明了 MFGM 蛋白的特征[61]。CN 也与乳品质密切相关，杨永新等[62]利用2-DE 技术分离了低、中、高体细胞数和临床乳腺炎牛乳的乳蛋白，并利用 LC/MS/MS检测了相关蛋白的表达，最终得出乳中 CN水解程度随体细胞数的增加而增加，严重临床乳腺炎乳中的 CN 几乎全部水解而 WP 急剧增加的结论。以上研究表明，蛋白质组学技术在乳品质研究中不仅能揭示乳的蛋白质组成，还可以发掘相关调控机制。蛋白质组学技术还应用于蛋类产品，通过对蛋壳、蛋清、蛋黄和蛋黄膜中的蛋白质成分进行鉴定，发现酸溶性蛋壳基质中有520种蛋白质，卵黄膜中有137种蛋白，蛋清和蛋黄中也分别鉴定出165和255种蛋白质，进一步对蛋类进行蛋白质组学分析，挖 掘 出 与 蛋 品 质 相 关 的 差 异 蛋 白 和 调 控 蛋白[63]。在鸡蛋蛋白质分析鉴定研究中，Wang等[64]利用2-DE与 LC/MS/MS结合技术对鸡蛋蛋白进行蛋白质组分析，并阐明胚胎发育第1天蛋白质代谢情况，该试验共分析了91种蛋白质，其中37种属于原鸡蛋白，有19种蛋白质首次在蛋清中检测到，其中卵类黏蛋白均显著增加，而血红素结合蛋白和血清白蛋白前体显著降低。Qiu等[65]通过使用2-DE和 MALDI-TOF质谱技术对胚胎发育第1周白蛋白变化进行了分析鉴定，发现了孵育过程中表达显著变化的蛋白质，还验证了受精和未受精鸡蛋之间蛋清蛋白质变化的差异。蛋白质组学在毛绒用羊经济性状研究方面也有广泛应用。Almeida等[66]利用iTRAQ 技术对美利奴羊羊毛纤维结构、蛋白质组成变化及蛋白质对毛囊纤维形成的作用进行了研究，结果表明，限饲42d的羊毛纤维直径显著减小，而羊毛中高硫蛋白(KAP13.1)和高甘氨酸-酪氨酸蛋白(KAP6)家族表达显著增加，且 KAP13.1和 KAP6家族蛋白质表达水平与羊毛纤维直径显著相关。角蛋白(keratin，K)是羊毛的主要成分，研究表明，山羊绒毛产量和绒毛纤维质量均与 K 蛋白有关，高丽霞等[67]利用2-DE技术研究了12个月内内蒙古绒山羊不同发育节点毛囊蛋白的差异表达，并采用质谱法成功鉴定了12种蛋白质，结果发现，K1、K5、K71和 K254种角蛋白高水平表达与毛囊生长发育相关，通过观察还建立了皮肤毛囊蛋白表达谱，发现了毛囊休止与毛囊休止期蛋白表达量具有相关性，为内蒙古绒山羊毛囊生长发育的蛋白质组学研究及蛋白标记育种提供了理论依据。——论文作者：王欣悦，张 莉*
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