摘要：建立一种不同时期花生茎叶中芳樟醇含量的高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，HPLC)检测方法并测定其含量。以水为溶剂，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化花生叶中芳樟醇提取条件。结果表明：HPLC最佳检测条件为色谱柱VenusilXBPC18，流动相乙腈∶水为1∶1(体积比)，流速1.0mL/min，检测波长205nm，在0.2μg~1.0μg范围内，芳樟醇浓度与峰面积呈现良好的线性关系，平均回收率为100.25%，相对标准偏差为1.40%。花生叶中芳樟醇最优提取条件：料液比1∶100(g/mL)、提取温度90℃、提取时间20min;不同时期花生叶中芳樟醇含量均高于茎，其中初花期花生叶中芳樟醇含量是茎的4.0倍，成熟期花生叶中芳樟醇含量是茎的3.5倍。
关键词：高效液相色谱法;芳樟醇;花生茎叶;提取;正交试验
花生茎叶为豆科落花生属(Arachis)植物落花生(A.hypogaea)的地上部分[1]，我国是花生生产大国，每年产生花生茎叶约有200万吨(干重)[2]，但花生茎叶主要作为动物饲料以及燃料使用，甚至很大一部分被直接丢弃，造成了极大的浪费。研究表明，从花生茎叶中分离得到的化合物主要有有机酸类、油脂类、脂肪烷烃类、多酚类以及芳樟醇类物质[3]，具有镇静催眠[4-8]、降压[9]、抗氧化[10-11]等作用。早在明洪武年间，我国民间就有花生茎叶入药的记载，近代编纂的《中药大辞典》中明确记载花生茎叶具有治疗抑郁、焦虑和失眠的功效，以及《中华本草》中提到花生叶水提液250g/kg灌胃不引起小鼠死亡。邓磊等[12-13]研究发现花生茎叶中芳樟醇是改善睡眠的物质基础之一，能够显著干预小鼠大脑中与睡眠相关的4条信号通路，从而实现对睡眠的积极调控。民间不少地方的人们也常将花生叶水煮后饮用，以缓解失眠多梦。
近年来，花生茎叶助眠的研究主要集中在对花生茎叶挥发性油成分的鉴定及花生茎叶经水提和有机溶剂提取后，在动物助眠实验方面的简单对比，针对助眠成分提取的工艺优化及提取物中的助眠成分分析涉及较少。因此本研究以助眠成分之一芳樟醇为检测指标，采用茎叶分离的方式，在单因素试验的基础上，对花生叶中助眠成分芳樟醇的提取及测定条件进行优化，从而提高花生叶中芳樟醇的溶出率，并分析比较初花期和成熟期花生茎、叶中芳樟醇的含量差异及变化，以期为花生茎叶相关助眠产品的开发提供理论依据和参考，促进花生茎叶资源的综合、高效利用，为失眠症患者日常非医改善睡眠提供新的途径。
1材料与方法
1.1材料与试剂
初花期、成熟期花生茎叶：自采于山东省济宁市泗水县张庄镇;芳樟醇标准品：纯度≥99%，艾勒科技有限公司;无水乙醇(分析纯)：天津市北辰方正试剂厂;乙腈(色谱纯)：天津市圣信唯科技有限公司。
1.2仪器与设备
400A多功能粉碎机：永康市红太阳机电有限公司;DHG-9625A热风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司;CA-1115旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂;LGJ18S真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司;Milli-Q纯水仪：天津奥佳科技股份有限公司;Agi-lent1260高效液相色谱仪(配紫外检测器)：安捷伦科技有限公司。
1.3试验方法与步骤
1.3.1芳樟醇标准溶液的配制
精密称取芳樟醇标准品20.00mg，置于5mL棕色容量瓶中，加入无水乙醇使其溶解，并定容至刻度，摇匀，制得4mg/mL的芳樟醇标准溶液，再准确吸取4mg/mL芳樟醇标准溶液250μL至10mL的容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，摇匀，得0.1mg/mL的芳樟醇标准品溶液作为母液，4℃下避光存放备用。
1.3.2样品制备
将收获的初花期和成熟期的花生茎叶，清洗后热风干燥至水分含量至5%，分别将茎叶分离、粉碎，过40目~60目筛，分别经料液比1∶100(g/mL)，90℃热水浸提2次，每次20min，纱布过滤，合并2次滤液，将滤液经旋转蒸发仪浓缩15倍后，4000r/min离心10min，取上清液，置于-80℃冰箱冷冻过夜，再经真空冷冻干燥得花生茎、叶冻干粉。
分别精密称取1.00g初花期、成熟期花生茎、叶冻干粉末，置具塞比色管中，向花生叶冻干粉中分别加入无水乙醇8mL，花生茎冻干粉中分别加入无水乙醇5mL，摇匀，取上清液，过0.2μm滤器，即得。
1.3.3液相色谱条件
色谱柱：VenusilXBPC18(4.6mm×150mm，5μm);流动相为以乙腈∶水=1∶1(体积比);流速1.0mL/min，紫外检测波长为205nm，柱温为30℃，进样量10μL。
1.3.4方法学考察
分别从0.1mg/mL芳樟醇标准品母液中准确吸取20、40、60、80、100μL至10mL棕色容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，制成梯度浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL芳樟醇标准品溶液，按1.3.3的色谱条件进样测定，以制作标准曲线。
分别取同一芳樟醇标准品溶液、同一样品溶液、1.3.2条件下平行制备的6份样品溶液及加标样品溶液(精密称取6份已知芳樟醇含量的花生叶冻干粉0.50g，分别准确加入0.1mg/mL芳樟醇标准品溶液20μL)在1.3.3的最优色谱条件进行分析检测，根据芳樟醇色谱峰的峰面积计算相对标准偏差(relativestan-darddeviation，RSD)，以此分析精密度、稳定性、重复性及样品加标回收率。
1.3.5花生叶中芳樟醇提取条件的优化
1.3.5.1单因素试验
将干燥后的花生叶经粉碎机粉碎，分别过20~40、40~60、60~80、80~100目筛后，称取适量花生叶干粉，以水作为提取溶剂，在料液比分别为1∶50、1∶70、1∶100、1∶125、1∶150(g/mL)，提取温度分别为80、85、90、95、100℃，提取时间分别为5、10、20、30、40min的提取条件下，提取2次进行单因素试验，再将滤液分别合并、浓缩、冻干、复溶后，经高效液相色谱测定芳樟醇含量，分别考察不同提取条件对花生叶中芳樟醇含量的影响。
1.3.5.2正交试验
在单因素试验基础上，设计L(934)正交试验优化提取条件，分别考察粉碎度、料液比、提取温度、提取时间对花生叶中芳樟醇含量的影响，以确定最佳提取条件，正交试验因素和水平见表1。
1.4数据统计分析
数据均采用Excel2010和SPSS19.0软件进行处理及统计分析。
2结果与分析
2.1方法学考察
2.1.1芳樟醇标准曲线及定性分析
以浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)进行回归分析，绘制标准曲线见图1，回归方程为Y=42.85X+0.25，相关系数R2=0.9994，表明在0.2μg~1.0μg范围内，芳樟醇峰面积值与进样量的线性关系良好。标准品、样品的色谱图见图2、图3，标准品和样品都在7.2min出峰且芳樟醇峰和样品中的其他组分均能达到基线分离。
2.1.2精密度分析
取同一芳樟醇标准品溶液，在1.3.3的色谱条件下，连续重复进样6次，结果见表2。芳樟醇标准品峰面积的RSD为1.33%(n=6)，表明该方法有良好的精密度。
2.1.3稳定性分析
取同一样品溶液，在1.3.3的色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、10h进样测定，结果见表3。
供试品溶液中芳樟醇峰面积的RSD为1.41%(n=6)，表明该试验中芳樟醇在放置10h内稳定性良好。
2.1.4重复性分析
取1.3.2条件下平行制备的同一样品溶液6份，按1.3.3的色谱条件进行分析检测，结果见表4。
供试品溶液中芳樟醇峰面积的RSD为1.30%(n=6)，表明该方法重现性优良。
2.1.5样品加标回收率分析
取加标样品溶液，按1.3.3的色谱条件进行分析检测，结果见表5。
平均加样回收率为100.25%，RSD=1.40%，表明该方法的加样回收良好，结果可靠，可以用于花生茎叶中芳樟醇含量的测定。
2.2花生叶中芳樟醇提取条件的优化
2.2.1单因素试验
粉碎度和料液比对花生叶芳樟醇含量的影响见图4、图5。
由图4可知，当粉碎度为60目~80目时，芳樟醇含量达到最高;当粉碎度在80目以上时，芳樟醇含量明显下降，可能是由于较细的颗粒会因其表面积过大，产生吸附作用，导致其扩散速度下降，溶出率下降[14]。由图5可知，随溶剂用量的增加，芳樟醇含量逐渐增大，当料液比为1∶100(g/mL)时，含量达到最大值;继续增加溶剂用量，芳樟醇含量趋于平稳，可能由于在一定料液比的条件下，芳樟醇的溶出量达到了饱和，之后则含量基本不再变化[15]。因此，综合考虑选择粉碎度为60目~80目、料液比为1∶100(g/mL)。
由图6可知，在80℃~90℃时，随温度升高，芳樟醇含量快速增加，继续升高温度，芳樟醇含量基本不变，可能与芳樟醇易挥发的性质有关，过高的温度迅速增加了芳樟醇挥发，最终使得溶出与挥发达到动态平衡。由图7可知，在10min内时，芳樟醇含量随时间的延长增加较缓慢，10min~20min，芳樟醇含量迅速增加，20min以后则芳樟醇含量增加特别缓慢，可能是随时间延长，水温降低，使得溶出速度大大降低。因此，综合考虑选择温度为90℃、提取时间为20min。
2.2.2正交试验
正交试验结果及方差分析见表6和表7。
由表6可知，最优提取条件为A1B2C2D2，即粉碎度40目~60目、料液比1∶100(g/mL)、提取温度90℃、提取时间20min。在此条件下验证试验测得花生叶中芳樟醇含量为2.32mg/kg。由表7可知，料液比和提取温度对花生叶中芳樟醇的提取有显著影响，而提取时间和粉碎度对其提取的影响差异不显著。各提取因素对花生叶中芳樟醇含量提取的影响主次顺序为：料液比>提取温度>提取时间>粉碎度。
2.3不同时期花生茎、叶中芳樟醇含量的测定
分别取1.3.2条件下制备的初花期、成熟期的花生茎、叶，按1.3.3的色谱条件进行分析检测，平行测定3次，依据测得的峰面积计算芳樟醇的含量，并对其进行统计学分析，结果见表8。
由表8可知，不同时期花生叶中芳樟醇含量均高于花生茎，其中初花期花生叶中芳樟醇含量是茎的4.0倍，成熟期花生叶中芳樟醇含量是茎的3.5倍，且初花期和成熟期花生叶中芳樟醇含量无明显差异。
3结论
建立一种测定花生茎叶中芳樟醇含量的高效液相色谱法：色谱柱为VenusilXBPC18，流动相为乙腈∶水=1∶1，流速1.0mL/min，检测波长205nm，柱温为30℃，进样量10μL。并在单因素试验的基础上，通过正交试验确定花生叶中芳樟醇的最佳提取条件：粉碎度40目~60目，料液比1∶100(g/mL)，提取温度90℃，提取时间20min。结果表明：所建立的花生茎叶中芳樟醇的高效液相色谱分析方法具有较好的精密度、稳定性、重现性，平均回收率为100.25%，RSD为1.40%，可作为花生茎叶中芳樟醇的含量的测定。此高效液相色谱法对优化条件下得到的不同时期花生茎、叶中的芳樟醇含量进行测定，不同时期花生叶中芳樟醇含量均高于茎，其中初花期花生叶中芳樟醇含量是茎的4.0倍，成熟期花生叶中芳樟醇含量是茎的3.5倍，并且初花期和成熟期花生叶中芳樟醇含量无明显差异。
不同时期花生茎叶中芳樟醇含量的测定相关期刊推荐：《植物生理与分子生物学学报》(曾用刊名：植物生理学报)，1964年创刊，主要刊载植物生理学和植物分子生物学及其相关领域有创新结果的原始论文、结合作者自己研究工作的专题综述等。本刊是我国刊载植物生理学科方面的权威性刊物，具有很高的学术地位。历年来该刊的影响因子和总被引次数均名列前矛，全国生物类期刊中排名第4位。有投稿需求的作者，可以咨询在线编辑老师。
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