摘要:选用3种常用的黄酮显色方法，通过波长扫描分别确定标准对照品芦丁及柳花80%乙醇提取物在各显色方法下的吸收波长并建立标准曲线。按照标曲的方法测定柳花80%乙醇提取物中总黄酮含量，并对各测定方法的精密度、稳定性、重现性及加样回收率进行测定。最终确定柳花总黄酮测定方法为:以芦丁为对照品，AlCl3显色法，检测波长为410nm;在此条件下，该方法的精密度、重现性、稳定性及加样回收率的相对标准偏差(RSD)分别为4.62%、3.91%、5.96%和(97.91±0.08)%。
关键词:柳花;总黄酮;芦丁;分光光度法
柳树是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)的多年生木本植物，种类十分多，资源也很丰富。柳树是一种重要的园林绿化植物，且其皮、根、嫩枝和叶在民间也具有悠久的药用历史[1]。研究数据表明，柳属的植物普遍含有大量的黄酮类化合物。目前，文献已发现的黄酮类化合物有:黄酮醇类、黄酮类、二氢黄酮醇类、双黄酮类、查耳酮类以及黄烷醇类等[2]。而本文中用到的试验材料柳花为一种名为准噶尔柳的柳树上结的花。准噶尔柳主要分布在新疆乌苏市，属于灌木，不吐絮，但开花，朵朵似菊，干而不凋。《乌苏县志》亦有记载:柳花乃本境特产，为老柳丛生，结花，入夏碧绿，花小榻叠，若含苞之菊，可当茗，性凉，解暑，世称柳花茶。柳花茶的制作工艺2010年被列为自治区级非物质文化遗产，随着准噶尔柳树面积逐年减少，传统的柳花茶制作技艺正在逐渐消失。通过本文研究，为柳花茶产业的可持续发展提供理论依据。
黄酮类化合物泛指两个苯环通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物，包括黄酮、黄酮醇、异黄酮、查尔酮、双黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇和黄烷酮等一系列化合物以及其衍生物[3-4]。黄酮类化合物以游离态或甙的形式广泛存在于蔬菜、水果等植物中，一般呈黄色。近年来，不断发现黄酮类化合物具有多方面的功能，比如槲皮素、芦丁能增强心脏收缩;黄芩苷可抗菌消炎;杜鹃素能止咳化痰;汉黄芩素可抑制肿瘤生长;水飞蓟素有保肝作用等[5-8]。
不同方法测定柳花中总黄酮含量的比较相关期刊推荐：《现代食品科技》(月刊)创刊于1985年，由华南理工大学主办。本刊立足广东，辐射全国，作为广东地区唯一的、拥有国内、国际刊号的食品科技杂志，本刊以报导食品的新成果、新产品、新技术、新工艺及科技动态为已任，是广东省食品科技的桥头堡，在广东食品界拥有举足轻重的作用本刊设有：基础研究、工艺技术、食品安全与检测、专题与论述、教学探索、专题与论述等栏目。
黄酮类化合物是一类受到广泛关注的生理活性物质，关于测定植物中其含量的研究资料十分丰富。目前植物中总黄酮含量的测定方法主要有紫外分光光度法(UV)、高效液相色谱法(UPLC)等，由于UV法重复性好、准确度高、简便易操作、设备易得，故该法应用最为广泛[9-12]。其中，直接测定法、三氯化铝显色法、亚硝酸钠-硝酸铝显色法为UV法中最常用的三种方法[13-16]。
本实验采用直接测定法、三氯化铝显色法、亚硝酸钠-硝酸铝显色法3种UV法对柳花中总黄酮的含量进行测定，比较三种方法测定结果的偏差率，目的是确定一种最适合于柳花总黄酮测定的方法，为其的开发利用研究提供实验基础与数据支持。
1实验
1.1材料
1.1.1材料与试剂
无水乙醇(AR)，西安化学试剂厂;甲醇(AR)，天津富宇精细化工有限公司;三氯化铝(AR)，天津市盛奥化学试剂有限公司;硝酸铝(AR)，北京化工厂;亚硝酸钠(AR)，西安化学试剂厂;氢氧化钠(AR)，上海试四赫维化工有限公司;芦丁，中检所标准品;柳花，新疆乌苏市。
1.1.2仪器
UV-2700紫外分光光度计，日本岛津公司;RT-20A碎样机，北京开创同和科技发展有限公司;TE612-L电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司;HHS电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司;H50冷却水循环机，莱博科泰公司。
1.2方法
1.2.1柳花中总黄酮的提取
称取柳花样品粉末1.0000g，精确称量，置具塞50mL锥形瓶中，加入80%乙醇50mL，充分浸润后，80℃冷凝回流2h，充分混匀后过滤，滤液用80%乙醇溶液补足至50mL，准确吸取滤液5mL，用甲醇稀释定容至50mL作为样品使用液，备用。
1.2.2芦丁对照品溶液的配制
准确称取芦丁对照品7.8mg，加入适量甲醇充分溶解后，用甲醇定容至25mL，摇匀备用，配成质量浓度为0.3120mg/mL的芦丁对照溶液，备用。
1.2.3柳花中总黄酮含量的测定
1.2.3.1三种显色方法测定总黄酮含量
(1)直接测定法:准确吸取柳花样品使用液1mL于10mL比色管中，用甲醇定容至后，充分混匀，静置5min，待其稳定后测定吸光度值;
(2)三氯化铝(AlCl3)显色法:准确吸取柳花样品使用液1mL于10mL比色管中，加入1%的AlCl3溶液4mL，用甲醇定容，充分混匀后，40℃水浴显色20min后测定吸光度值;
(3)亚硝酸钠-硝酸铝(NaNO2-Al(NO3)3)显色法:准确吸取柳花样品使用液1mL于10mL比色管中，加入甲醇定容至5mL，混匀后加入5%的NaNO2溶液0.3mL，充分混匀，静置反应6min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.3mL，充分混匀，静置6min后，加入4%的NaOH溶液4mL，用甲醇定容至，充分混匀后测定其吸光度。
1.2.3.2最大吸收波长确定
将柳花样品使用液和标准对照品分别按1.2.3.1中三种显色方法显色后，分别在200～800nm范围内进行高速扫描，根据扫描图谱结果，为每种方法确定适宜的吸收波长。
1.2.3.3标准曲线的建立按照
1.2.3.1显色方法，分别建立对照品在3种显色方法下的标准曲线。
1.2.3.4显色方法精密度测定
准确吸取柳花样品使用液3份，按照1.2.3.1中显色方法显色，并在各方法的适宜波长处测定吸光度值，计算各方法测定结果的相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)值。
1.2.3.5显色方法重复性测定
准确称取1.0000g柳花粉末3份，按照1.2.1中的方法制备柳花样品使用液。分别按1.2.3.1中显色方法对3份柳花样品使用液进行显色，并在各显色方法选定的波长下测定吸光度值，计算各方法测定结果的RSD值。
1.2.3.6显色方法稳定性测定
准确吸取柳花样品使用液，按照1.2.3.1中三种显色方法显色，并在各方法选定的吸收波长下测定样品的吸光度值，每隔0.5h测定1次，共测定5次，计算各显色方法测定结果的RSD值。
1.2.3.7显色方法加样回收率测定
取适量柳花样品使用液，各加一定量的对照品芦丁，分别按三种显色法操作步骤显色后，测定其吸光度值，并计算出加样回收率和各显色方法测定结果的RSD值。
2结果与分析
2.1三种显色方法最大吸收波长的确定
直接测定法结果见图1，标准品芦丁在360nm处有最大吸收峰，柳花样品的最大吸收峰在340nm处，故本方法选择标准品芦丁的最大吸收峰360nm为测定波长。三氯化铝显色法结果见图2，标准品芦丁和柳花样品在410nm处均有最大吸收峰，且二者的最大吸收峰复合度比较一致，因此本方法选择以标准品芦丁和柳花样品的共同最大吸收峰410nm为测定波长。
亚硝酸钠-硝酸铝显色法结果见图3，标准品芦丁在500nm处有最大吸收峰，样品显色后为红色，经过多次扫描得出样品在480nm处有吸收峰。因此本方法选择以标准品芦丁的最大吸收峰500nm为测定波长。
2.2三种显色方法标准曲线的建立
以芦丁对照品配置成不同梯度浓度，每个浓度重复测定三次，取吸光度值的平均值，以对照品浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值(ABS)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程(A为吸光度，C为浓度(μg/mL):直接显色法标准曲线:A=0.0307C-0.0171，R2=0.9994;三氯化铝显色法标准曲线为:A=0.0291C-0.0078，R2=0.9994;亚硝酸钠-硝酸铝显色法标准曲线:A=0.0115C-0.0021，R2=0.9991。三种方法的相关系数R2表明标准曲线在芦丁对照品浓度范围内线性良好。
2.3三种显色方法总黄酮含量测定比较
三种显色方法总黄酮含量测定的结果见表1，直接测定法和三氯化铝显色法测定结果较为接近，总黄酮提取率分别为2.39%和2.17%;亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定结果较高，总黄酮提取率为11.69%。
综合各显色方法的精密度、重现性、稳定性、加标回收率的相对标准偏差(RSD)数值分析，亚硝酸钠-硝酸铝显色法的各项指标的RSD值最小，其加标回收率偏高且其RSD值过高;直接测定法的各项指标的RSD值与三氯化铝显色法的各项指标的RSD值相比略高;表明在误差范围内三氯化铝显色法更适宜测定柳花样品中总黄酮的含量，其准确度更高。
由表1可知亚硝酸钠-硝酸铝显色法测得的总黄酮含量最高，总黄酮提取率为11.69%。其原理是先用NaNO2还原黄酮，黄酮类化合物中的羟基再与Al3+络合，最后加入NaOH溶液(碱性条件)，使黄酮类化合物开环，生成红色络合物从而显色定量。经研究发现，该方法不具备专一性，部分非黄酮类化合物也可发生显色反应。本实验柳花醇提液中总黄酮并未经过纯化处理，可能这些杂质能与Al3+络合从而干扰测定。另外该方法使用了NaOH溶液，样品液中含有天然色素，部分色素可能会在碱性条件下显色，从而使测定结果产生偏差。
3结论
(1)直接测定法加标回收率偏低且稳定性RSD值偏高，柳花提取液中可能含色素、甾体、果胶、低聚糖及多酚类等物质，这些杂质会干扰直接测定法，使得结果不准确;亚硝酸钠-硝酸铝显色法加标回收率的RSD值偏高，且该方法不具备专一性，部分非黄酮类化合物可发生显色反应，样品中的部分色素也可能会在碱性条件下显色，从而使测定结果产生偏差。
(2)三氯化铝显色法标准品与柳花样品的最大吸收峰较为一致，且总黄酮测定结果在误差范围内准确度较高，反应时黄酮类物质反应较强，而对色素、酚酸等非黄酮类物质的反应极弱，可见该法对黄酮类化合物的专属性较强，适用于柳花总黄酮含量的测定。
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