摘要:随着社会经济发展，活性氮源随人为活动逐年递增，导致氮沉降相应增加，由此带来的生态环境问题也日益严重.本研究基于细菌16SrRNA基因高通量测序技术，分析长期人工模拟氮沉降氮输入量为0、1、4、8、32g·(m2·a)-1对干旱半干旱区草原土壤微生物群落结构的影响.结果表明，模拟氮沉降7a增加了土壤中可利用氮含量，引起草原土壤酸化.高通量测序结果表明，细菌OTU(operationaltaxonomyunit)数量随氮输入量的增加呈现增加的趋势，高氮处理[8g·(m2·a)-1和32g·(m2·a)-1]显著高于低氮和对照处理;细菌α多样性指数呈现先增加后降低的趋势.不同氮输入水平下土壤细菌群落结构差异显著，且与土壤pH和氮的有效性显著相关.不同细菌相对丰度在纲的水平对氮输入的响应趋势不同.氮的长期大量输入可直接或间接通过改变土壤性状而影响草地土壤细菌群落结构和多样性.
关键词:氮沉降;细菌群落;多样性;高通量测序;温带草原
自工业革命以来，由工业生产、废弃物处理、化肥使用等人类活动产生的活性氮不断增加并以干、湿沉降的方式进入地球表面，带来一系列的生态问题，如土壤酸化、植物病虫害增加、海洋生态系统衰退等.据估计，2005年全球氮沉降量为25～40Tg，而到2100年将达60～100Tg[1].由氮沉降引起的土壤生态环境问题已成为各国的研究热点.中国当前的大气氮沉降远高于全球平均水平，降水中硝酸根离子浓度与美国、日本相接近，铵离子浓度则高于美国和日本[2].在氮沉降增加背景下，现有的研究多关注森林生态系统的土壤微生物，而对草原生态系统土壤微生物群落响应特征还知之甚少.中国草地面积占全国国土面积的41.7%[3]，是人类活动和全球气候变化的直接承受者，在全球碳氮循环和气候变化响应中发挥重要作用.
氮的有效性不仅是调控碳与气候变化反馈机制的重要因子，同时也是影响植物群落初级生产力和多样性的关键元素[4].氮的大量输入能够促进植物吸收，有利于提高地上部分生物量和生产力[5，6];另有研究表明长期施肥引起草地生态系统物种丰富度下降[7]，并加剧其它元素对生产力的限制[8].另外，氮沉降通过影响氮有效性、pH、C/N等直接或间接地影响土壤微生物群落结构和功能.Lovell等发现[9，10]，在草地土壤中，短期施氮能提高土壤微生物量，而长期施氮则会降低.另外，有研究表明氮沉降会增加土壤有效氮含量，导致C/N降低，从而使得真菌与细菌生物量比值降低[11～13].氮的大量输入能够改变土壤碳氮比，进而影响微生物介导的碳氮循环过程[14]，降低土壤细菌多样性[15，16]，并改变细菌等微生物分布格局[17，18].
氮素是干旱半干旱草原生态系统的主要限制性因子之一[5]，对全球氮沉降的响应较为敏感.干旱半干旱地区草原的氮主要以降雨、降雪等脉冲式进入土壤中.据报道，中国内蒙古温带草原氮沉降量为3.43g·(m2·a)-1，且有持续增加的趋势[19].因此，氮沉降的增加不仅影响干旱半干旱地区生态系统的生产力，对土壤氮转化过程、微生物的多样性也存在深远影响.本研究以人工施氮的方式模拟自然氮沉降，结合土壤化学性质，分析不同氮输入量对草原土壤细菌群落结构的影响，对认识地下生态系统对氮沉降的响应机制提供重要的参考.
1材料与方法
1.1实验地点与土壤采集
本实验地点位于内蒙古锡林郭勒盟多伦县的中国科学院植物研究所多伦恢复生态学实验示范研究站十三里滩研究基地的实验样地(116°17'E，42°2'N).多伦县属于典型温带半干旱大陆性季风气候，年平均气温为2.1℃，年平均降水量385.5mm.实验样地的主要优势植物为克氏针茅(Stipakrylovii)，冷蒿(Artemisiafrigida)，冰草(Agropyroncristatum)，糙隐子草(Cleistogenessquarrosa)，星毛委陵菜(Potentillaacaulis)和茵陈蒿(Artemisiacapillaries)[20].土壤类型为栗钙土，土壤机械组成分别为砂粒62.8%、粉粒20.3%、黏粒17.0%，土壤容积密度为1.3g·cm-3，pH7.1.氮沉降模拟实验始于2003年，截至2009年5月采样，已持续7a，具体的氮处理设置如文献所述[21].在本研究中，选取其中5个施氮处理:0、1、4、8、32g·(m2·a)-1(分别标注为N0、N1、N4、N8、N32)，采集土壤样品，分析土壤细菌多样性.
每个样方用5cm直径的土钻采取0～10cm表层土壤，去除石砾和植物残根后，5个土柱混合制样.装于无菌密封袋，置于冰上，运送至实验室.每个处理采集3个重复，共15个样品.过2mm筛后，一部分保存于4℃，用于化学性质测定，另一部分保存于-80℃，用于DNA提取.
1.2土壤化学性质测定
土壤pH以水土比1∶2.5，通过DELTA320pH仪测定.土壤中NO-3-N和NH+4-N用2mol·L-1KCl浸提后，用连续流动分析仪(SAN++，Skalar，Holland)测定.总碳(totalcarbon，TC)和总氮(totalnitrogen，TN)用元素分析仪测定(VarioELⅢ，Elementar，Germany).土壤有效磷用0.5mol·L-1NaHCO3(pH=8.5)浸提后，用钼蓝比色法测定.土壤含水量用烘干法测定.
1.3DNA提取和测序
土壤基因组DNA用MOBIOPowerSoilDNAIsolationKits提取，具体步骤按说明书进行.所得DNA稀释10倍后进行PCR扩增，以降低对PCR反应的抑制作用.细菌使用引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R(5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')扩增细菌16SrRNAV4区，用于焦磷酸测序.515F引物前端加454接头序列A，4-bplinker序列(TCAG)和10个碱基的MIDbarcodes;806R引物前端加454接头序列B和4-bplinker序列(TCAG)[22，23].PCR扩增体系(30μL):1×PCRbuffer，3.0mmol·L-1MgCl2，400μmol·L-1dNTPs，2.5UExTaqTMDNA聚合酶(TaKaRa，Shiga，Japan)，含barcodes上下游引物各0.5μmol.PCR扩增条件:94℃预变性5min，34个循环95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸60s，最后72℃再延伸60s.PCR产物用WizardSVGelandPCRClean-UpSystem(Promega，Madison，WI)进行纯化后，用NanoDrop1000(ThermoScientific，Wilmington，DE)测定纯度和浓度，再用Quant-iTdsDNAHSAssayKits(invitrogen，Eugene，OR)进行Qubit荧光定量检测.等摩尔量的PCR产物混合后送至Macrogen(Seoul，Korea)，用Roche/454GSFLXTitanium平台测序.
1.4测序结果分析
用Mothur1.30.1软件对序列进行后续的处理和分析[24].用Shhh.flows对原始序列质量过滤后，进行长度过滤并比齐，具体步骤如文献[25]所述.过滤后的序列与SILVA数据库进行比对[26]，用chimera.uchime去除嵌合体，而后用平均邻域法基于97%序列相似度挑选可操作分类单元(operationaltaxonomyunit，OTU)，细菌代表序列用RDP分类方法基于Greengenes数据库进行分类，置信度设置为0.8.绘制稀释曲线，并计算α多样性指数(Chao)[27].为了降低取样误差，每个样品用Mothur进行重取样(每个样品按1229条序列重取样).
1.5数据分析
使用R语言Vegan包，基于OTUBray-Curtis相异性矩阵和UniFrac(系统发育距离)距离来检验不同氮施加水平对细菌群落结构的影响;用非度量多维尺度分析(NMDS)检验不同处理以及对照间细菌群落组成的差异性.用单因素方差分析(One-wayANOVA，SPSS19.0)不同氮输入水平下细菌多样性的差异显著性(P<0.05)，采用Spearman相关系数计算细菌相对丰度和土壤理化性质的相关性，用Origin8.0对氮输入量和细菌多样性进行二元多项式回归分析.
2结果与分析
2.1土壤化学性质
土壤化学性质如表1所示，施氮7a草地土壤pH随氮施加量增加而显著降低，由7.04降至5.96.处理N1、N4和N8土壤NO-3-N和NH+4-N含量与N0处理相比无显著差异，但处理N32，即当外源氮输入量为32g·(m2·a)-1时则显著增加.土壤Pi、TC、TN和C/N比在不同施氮处理间无显著差异。
2.2不同处理土壤细菌群落结构和组成
获取的土壤细菌序列经Mothur软件处理后得到137978条高质量的16SrRNA基因序列，97%置信度下可分为6232个OTU，且土壤样品中的OTU数呈现出随氮输入量的增加而上升的趋势(表1).但土壤细菌Chao指数却随氮输入量的增加呈现抛物线的递增趋势(图1)，即在较低[1g·(m2·a)-1]和较高[32g·(m2·a)-1]氮输入时，与对照无显著差异，而在4和8g·(m2·a)-1时，Chao指数则显著增加.基于各处理土壤细菌群落结构的NMDS分析结果如图2(a)所示，可以发现所有氮添加的处理与对照处理的土壤细菌群落结构差别显著，且低氮(N1、N4和N8)与高氮处理(N32)也分别聚集于不同排序区，可见氮的输入对土壤细菌群落产生了显著影响.
基于各处理土壤细菌门水平的群落相对丰度组成分析如图2(b)所示.各样品中，酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和放线菌门(Actinobacteria)均为优势菌群，平均相对丰度分别为28.5%、18.1%、18.1%和13.1%，另外0.84%的序列为未知序列.其中，变形菌门(Proteobacteria)相对丰度在N1、N4、N8处理中分别为10.4%、10.2%、15.1%，显著低于N0(26.8%)和N32(27.4%)，即随氮输入量增加呈先降低后上升的趋势.酸杆菌门(Acidobacteria)则相反，N1处理显著高于N0，而N4处理中相对丰度最高，达到41.9%，N32处理与N0处理无显著差异.疣微菌门(Verrucomicrobia)随氮输入量增加其相对丰度变化趋势与酸杆菌门(Acidobacteria)类似.N1和N4放线菌门(Actinobacteria)相对丰度低于N0，N8和N32高于N0，且在N32达到最大值.
2.3土壤基本性质与门水平细菌群落相对丰度的相关性
土壤细菌群落与土壤基本性质的相关性分析如表2所示.从中可见，氮输入量与疣微菌门(Verrucomicrobia)呈负相关(P=0.028)，与放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)相对丰度呈显著正相关(分别为P=0.002、P=0.020).其他环境因子中，土壤TN、TC与疣微菌门呈正相关，而与其他门水平细菌相对丰度无显著相关关系;NO-3-N和NH+4-N与放线菌门(Actinobacteria)呈显著正相关(P=0.001和P=0.007).pH仅与疣微菌门(Verrucomicrobia)呈显著正相关(P=0.022)，而与其他细菌呈显著负相关或无显著相关.且与氮输入量和细菌相关的种类一致，但相关性相反，说明N施加通过改变pH从而间接地影响了多种细菌的丰度(图3).变形菌门(Proteobacteria)与土壤含水量呈正相关关系，但其在纲水平却与多个化学因子显著相关，例如α-变形菌纲与氮施加浓度、土壤含水量呈正相关，与pH呈负相关;δ-变形菌纲与氮施加浓度、含水量、NO-3-N、NH+4-N呈显著正相关，与pH呈负相关.细菌Chao指数与碳氮比呈显著正相关，与其他因子无显著相关性;OTU数与氮输入量呈显著正相关.
3讨论
氮沉降增加能直接或间接地影响地下生态过程，包括土壤微生物的生长和繁殖.土壤微生物是土壤的重要组成部分，其群落结构的变化会影响土壤养分的有效性.氮沉降增加会通过增加土壤含氮量，从而促进土壤氮循环，同时也会增加土壤细菌丰度.有研究表明，氮沉降增加会促进土壤氮素吸收、加快土壤有机质矿化速率和陆地生态系统硝化作用及反硝化作用[28].本研究中，氮施加虽然对土壤中TN含量无显著性影响，但是会显著增加NO-3-N和NH+4-N含量，说明氮施加会促进土壤氮循环过程[29，30].土壤pH与氮施加浓度呈显著负相关关系(P<0.001)，说明氮沉降增加会使土壤酸化，这可能与氮施加浓度升高促进土壤硝化作用有关[28].另外，土壤酸化会改变土壤中金属离子的浓度，例如土壤铁、锰含量.因为在低pH条件下土壤锰含量增加，进而促使了植物叶片锰含量的增多，而锰的增多反过来抑制了植物对铁的吸收[31]，进而影响叶片的光合作用，导致土壤根系生长缓慢而影响土壤微环境，从而间接影响土壤细菌群落结构[14].长期氮添加条件下，即使土壤pH变化不显著，也可能会显著改变土壤微生物群落组成[32].在本研究中，氮施加直接增加了土壤细菌OTU数且显著改变了细菌群落结构组成[图2(a)]，不同细菌类群其相对丰度随氮施加浓度升高而出现不同的变化趋势;同时降低土壤pH，间接地影响了土壤细菌丰度.
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