摘要:以正辛醇和葡萄糖为原料,采用表达β-葡萄糖苷酶的基因工程菌作为全细胞催化剂,合成了正辛基葡糖苷,考察了不同条件对反应的影响。结果表明,表达β-葡萄糖苷酶基因工程菌全细胞为合成正辛基葡糖苷的良好催化剂,在葡萄糖与正辛醇的质量比1∶5、催化剂用量占原料总质量2.0%、体系初始含水质量分数13%、反应温度52℃、反应时间36h、pH=6条件下,葡萄糖转化率为58.91%,得到产物纯度大于99%。通过红外光谱、拉曼光谱、核磁共振氢谱对产物进行结构鉴定,表明合成产物为正辛基葡糖苷。
关键词:正辛基葡糖苷;全细胞催化;表面活性剂
0 引 言
随着人们环保意识的增强,开发新型的绿色表面活性剂变得越来越重要[1-2]。烷基糖苷作为一种易生物降解、环境友好的非离子型表面活性剂,在化妆品原料、药物和生物制剂众多高端领域有着十分重要的利用价值[3-4]。烷基糖苷的合成方法可大抵分为化学法和酶催化法[5]。目前,烷基糖苷的商业生产主要采用化学合成法,成本高, 产品纯度较低,多用于日化工业的洗涤产品,不能用于食品、医药和生物领域[6]。酶催化合成烷基糖苷的研究在我国处于初始阶段,在发达国家也仅处于实验室规模,酶催化合成烷基糖苷反应条件较为温和,工艺相对简单,产物纯度高,是一种有发展前途的方法[7]。微生物细胞可以在便宜的培养基上培养、储存并保持稳定的酶活性[8-10]。全细胞催化避免了酶的分离纯化,成本低廉,后续步骤容易分离,可以实现重复利用[11]。全细胞催化合成烷基糖苷反应条件温和,全细胞酶相对便宜、易保存,不存在副反应,产物纯度高,这为工业化提供了一条可行性选择[12]。本实验以葡萄糖和正辛醇为原料, 表达β-葡萄糖苷酶基因工程菌全细胞,以其作为催化剂,合成正辛基葡糖苷,考察了全细胞催化合成的影响因素。
1 实 验
1.1 原料与仪器菌株:表达β-葡萄糖苷酶基因工程菌,山东格德生物科技有限公司北京研发中心;pNPG(对硝基苯 基-β-D-葡 萄 糖 苷),美 国 Sigma 公 司;葡 萄糖、正 辛 醇、磷 酸 二 氢 钠、柠 檬 酸、Na2HPO4 · 12H2O 等,化学纯;乙腈、三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷,色谱纯。 UV1006M204型紫外分光光度计,上海山岳科学仪器有限公司;GC7890F 型气相色谱,上海天美科学仪器有限公司;傅里叶变换红外光谱仪, 美国 PE 公司;inVia型拉 曼 光 谱,雷 尼 绍 公 司; BrukerADVANCE Ⅲ 型核磁共振波谱仪,布鲁克公司。
1.2 实验方法
1.2.1 全细胞催化剂的制备
1.2.1.1 培养基的配制
斜面培养基:酵母浸粉0.5%、胰蛋白胨1%、葡萄糖0.25%、NaCl0.5%、K2HPO40.25%、卡那霉素0.005%、琼脂2%,121 ℃灭菌20min 种子培养基:蛋白胨1%、酵母粉0.5%、葡萄糖0.4%、NaCl1%、自然pH,121 ℃灭菌20min 液体培养基:酵母浸粉 0.7%、乳糖 0.2%、 Na2HPO4·12H2O0.7%、甘 油 0.5%、葡 萄 糖 0.07%、自然pH,121 ℃灭菌20min。
1.2.1.2 培养方法
将保存在-20 ℃的甘油菌接入固体斜面培养基,37 ℃活化2d,放入4 ℃冰箱备用。将斜面培养基中菌体接入种子培养基,37 ℃、200r/min恒温摇床培养12h。将处于对数生长期的种子培养液接种于液体培养基中,37 ℃、200r/min恒温摇床乳糖诱导3d [13]。测定全细胞催化剂的酶活力,保存在-20 ℃冰箱待用。
1.2.2 正辛基葡糖苷的合成方法
向三角瓶中加入适量的葡萄糖、缓冲溶液和全细胞催化剂,振荡30min,加入一定量用分子筛处理过的正辛醇,放入摇床至反应结束。将反应液过滤除酶、静置分层,取水相计算葡萄糖转化率。富集有机层,减压蒸馏除去大部分正辛醇,向得到的黏稠状样品中加入3~4倍体积的甲醇,加入硅胶后旋蒸,使产物吸附在硅胶上,过硅胶柱纯化(甲醇与乙酸乙酯体积比1∶10),旋蒸除溶剂后置于烘箱中干燥得产物[14]。气相色谱计算产物纯度,并对产物结构进行表征。
1.2.3 检测方法
1.2.3.1 酶活测定
配制2mmol/L 的 pNPG 溶液,将适当稀释全细胞液与 pNPG 溶液50 ℃预热15min,各取 1mL反 应 10 min,立 即 加 入 1.5 mL1 mol/L Na2CO3 终止反应。室温静置5min,测定405nm 处吸光度[15]。依标准曲线推算反应生成的对硝基苯酚量,计 算 酶 活。酶 活 单 位 定 义:pH 5.0、 50 ℃ 条件下,每分钟催化生成1μmoL对硝基苯酚所需的酶量。
1.2.3.2 葡萄糖转化率的测定
采用 3,5-二 硝 基 比 色 法 测 定 葡 萄 糖 转 化率[16]。测定 540nm 处吸光度,绘制 标 准 曲 线。测定待测溶液吸光度,计算葡萄糖转化率。
1.2.3.3 产物纯度测定
采用硅烷化柱前衍生-气相色谱法测定产物纯度[17]。取适量产物溶于乙腈,向0.3mL 乙腈溶液中加入三甲基氯硅烷0.1mL、六甲基二硅胺烷0.2mL,猛烈摇动30s,静置后取上层清液,气相色谱分析。
1.2.4 结构表征
利用傅里叶红外光谱仪测定IR 光谱,利用拉曼光谱仪测定产物 Raman光谱,判断产物的特征吸收峰。利用核磁共振氢谱对产品进行扫描, 鉴定合成产物。
2 结果与讨论
2.1 全细胞催化合成正辛基葡糖苷的影响因素
2.1.1 物料比对反应的影响
称取1g葡萄糖,催化剂用量为原料总质量的1.5%,体系初始含水质量分数15%,采用磷酸氢二 钠-柠 檬 酸 缓 冲 溶 液 调 节 pH 至 5,50 ℃、 160r/min摇床中反应24h。考察正辛醇用量对葡萄糖转化率的影响,结果见图1。结果表明,物料比对转化率的影响较大,当糖醇质量比为1∶5, 转化率达到最高值46.91%。对于该反应,正辛醇有两个重要作用,既是有机溶剂又是反应物;正辛醇的增加既有利于葡萄糖的分散溶解,还可使反应向合成糖苷的方向进行。但当糖醇质量比大于1∶5后,继续增加醇用量,转化率变化不大,同时残 醇 量 增 加,后 续 分 离 纯 化 工 作 的 难 度 增大[15]。因此,选择糖醇质量比为1∶5。
2.1.2 体系初始含水质量分数对反应的影响
称取1g葡萄糖,5g正辛醇,催化剂用量为原料总质量的1.5%,采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节pH 至5,50 ℃、160r/min摇床中反应24h。考察体系初始含水质量分数对葡萄糖转化率的影响,结果见图2。结果表明,随着含水质量分数的增大,转化率先增加后下降,体系初始含水 质 量 分 数 为 13% 时,转 化 率 达 到 最 高 值 48.02%。含水量过少会使全细胞酶处于黏稠的状态,不利于酶的活性,也不利于葡萄糖的溶解。随着反应程度不断加深,产物水不断产生,体系含水量增多,阻碍了反应向生成糖苷的方向进行。
2.1.3 温度对反应的影响
固定称取1g葡萄糖,5g正辛醇,催化剂用量为原料总质量的1.5%,体系初始含水质量分数为13%,采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节pH 至5、160r/min摇床反应24h。考察温度对葡萄糖转化率的影响,结果见图3。结果表明, 37~52 ℃葡萄糖转化率随着温度的增加而增大, 52 ℃时达到最大值51.52%,随后转化率下降。这是由于随着反应温度的不断升高,酶活力增大, 反应速率加快,转化率升高。但温度过高造成酶变性失活,转化率降低。
2.1.4 催化剂用量对反应的影响
称取1g葡萄糖,5g正辛醇,体系初始含水质量分数为13%,采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液 调 节 pH 至 5,52 ℃、160r/min 摇 床 反 应 24h。考察催化剂用量对葡萄糖转化率的影响, 结果见图4。结果表明,葡萄糖转化率随着催化剂用量的增大而增大,当催化剂用量超过2.0% 后,转化率增幅变小甚至下降。本实验以表达β- 葡萄糖苷酶基因工程菌全细胞为催化剂,当催化剂加入量较少时,反应速度较慢,而催化剂加入量较多时,由于体系中含水量较少全细胞酶无法完全溶解,影响酶活力,转化率甚至略微下降。因此,选择催化剂添加量为2.0%。
2.1.5 反应时间对反应的影响称取1g葡萄糖,5g正辛醇,催化剂用量为原料总质量的2.0%,体系初始含水质量分数为 13%,采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节 pH 至5,52 ℃、160r/min摇床中反应。考察反应时间对葡萄糖转化率的影响,结果见图5。结果表明,随着反应时间的延长,转化率增大,当反应时间到达 36h,再延长反应时间转化率 增 加 不 明显,适宜的反应时间是36h。
2.1.6 pH 对反应的影响
称取1g葡萄糖,5g正辛醇,催化剂用量为原料总质量的2.0%,体系初始含水质量分数为 13%,采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节pH, 52 ℃、160r/min摇床反应36h。考察 pH 对葡萄糖转化率的影响,结果见图6。结果表明,pH 对葡萄糖转化率影响较大。pH=6为反应的最适pH,转化率可达58.91%。这是因为全细胞酶催化反应易受pH 的影响,pH 过高或过低都会造成转化率下降。
2.2 产物的结构表征
2.2.1 红外谱图
图7是产物的红外光谱。从图7可以看出, 3400cm-1处归属于羟基的伸缩振动峰,2920~ 2850cm-1 归属于—CH3 和—CH2 的对称与 反对称伸缩振动峰,1600cm-1 归属于C—O—C糖苷键 的 振 动 峰,1100~1000cm-1 归 属 于 C— O—C与羟基上的C—O 的弯曲振动,915cm-1为葡萄糖吡喃环的振动峰,700cm-1处为亚甲基的弯曲振动峰。与文献[18]报道的谱图的特征吸收峰出峰位置基本一致。
2.2.2 拉曼光谱如图
8 所 示,2940cm-1 左 右 处 的 强 峰 为 C—H 反对称伸缩振动引起的[19]。1410cm-1处为 C—H 和 C—O—H 的面内变形振动产生的。 1100cm-1处归属于辛基葡萄糖 C—O—C 糖苷键的振动峰。
2.2.3 核磁共振氢谱
如图9 所示,δ=7.258(m,氘 代 氯 仿);δ= 4.307,糖 环 上 发 生 苷 化 反 应 C 上 的 H;δ= 3.287~3.893,糖基碳上和与糖基相连的烷基碳上氢的吸收峰;δ=1.266~1.618(2H,烷基碳上的氢);δ=0.891(CH3)[18]。由图8、9可知,所合成产物为目标产物。
2.2.4 硅烷化柱前衍生-气相色谱图
如图10所示,0.665 min处为溶剂乙腈峰, 1.123 min 处为产物正辛基葡萄 糖 苷 的 出 峰 位置。根据面积归一化法,除去溶剂计算产物纯度大于99% [17]。
3 结 论
采用表达β-葡萄糖苷酶工程菌全细胞催化合成正辛基葡萄糖,在葡萄糖与正辛醇质量比1∶5、工程菌全细胞用量为原料总质量的2.0%、体系初始含水质量分数为13%、反应温度为52 ℃、采用磷 酸 氢 二 钠-柠 檬 酸 缓 冲 溶 液 调 节 pH 至 6、 160r/min反应36h的条件下,葡萄糖转化率可达58.91%。全细胞酶来源广泛,成本低,应用表达β-葡萄糖苷酶工程菌全细胞催化合成正辛基葡萄糖,具有研究开发潜力和价值。
参考文献:
[1]王雪峰,张建娟.烷基糖苷系列表面活性剂泡沫性能研究[J].现代纺织技术,2017,25(1):51-55.
[2]高建静,马建中,吕斌.烷基糖苷的合成及其在制革工业中的应用前景[J].中国皮革,2017,46(6):37-40.
[3]SALMANS M,HEIDELBERG T,HUSSEN R S D,etal.Amide-basedsurfactantsfrommethylglucosideaspotentialemulsifiers[J].JournalofSurfactantsandDetergents,2014,17(6):1141-1149.
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