摘要：为了筛选磺化钻井液高效降解菌株，以新疆某磺化钻井液伤害土壤为菌源，磺化钻井液为唯一碳源，通过富集驯化分离筛选出一株降解磺化钻井液效率较高的菌株Xh8，经鉴定为Bacillusflexus。经生理生化及16SrRNA基因序列分析确定了其分类地位，并进行了单因素和正交试验以确定其降解特性。单因素试验表明Xh8生长最佳条件为：pH值为9.5、盐质量分数为4%、转速为150r/min、温度为35℃、接种量为10%、N源蛋白胨、P源K2HPO4。正交试验表明磺化钻井液COD降解最佳条件为：pH值为9.5、盐质量分数为4.5%、转速为150r/min、温度为35℃。培养7d，磺化钻井液COD降解率为22.9%。试验结果表明，Xh8可作为磺化钻井液降解的优良备选菌株。该研究可为进一步治理受到磺化钻井液伤害的地层提供理论指导。
关键词：磺化钻井液;降解菌;筛选;降解特性;弯曲芽孢杆菌;钻井废液;无害化处理
磺化钻井液是钻井过程中使用的循环流体，是液体、固体和化学处理剂的混合物[1]。为实现优质快速钻井，深井钻井工程常采用磺化钻井液体系，导致开发过程产生的钻井废水成为石油行业难处理的工业废水之一[2]，且其废弃物对环境的伤害日趋严重[3-4]，若不经有效处理，钻井废液会对周围环境尤其是土壤以及地表水和地下水质造成严重污染[5]。当前主要采用物化组合工艺对钻井废液进行处理[6]，现场应用表明，物化工艺化学药剂用量大、运行费用高。目前微生物修复工艺因其具有投资成本低和无二次伤害等特点，已成为最具价值和生命力的首选伤害治理工程技术[7]，在国内外降解有机物及废弃钻井液中已有报道[8-10]。常用的修复微生物有无色杆菌、不动杆菌、产碱杆菌、节杆菌、芽孢杆菌、黄杆菌、诺卡氏菌、假单胞菌和棒状杆菌等[11]。Li等[12]培育出的2株芽孢杆菌和1株不动杆菌，也能降解油基磺化钻井液。
单独处理磺化钻井液污染物耗时、见效慢且操作复杂，因此有必要筛选同时治理多重污染物的菌株。结合已报道的钻井废液降解菌的筛选、磺化钻井液无害化处理技术等[13-14]，不难发现一些降解菌具有耐受多种污染物的能力，因此筛选单菌同时治理多重污染是可以实现的。针对钻井过程产生的磺化钻井废液的难降解特点，以新疆某磺化钻井液伤害土壤为菌源，以褐煤树脂(SPNH)、磺甲基酚醛树脂(SMP)和复合离子大分子聚合物(FA-367)三者组成的磺化钻井液为唯一碳源富集驯化筛选降解磺化钻井液的单菌，探索其降解特性，为后期构建磺化钻井液降解混合菌剂和研究其伤害土壤生物修复提供理论指导和微生物资源。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
降解磺化钻井液的菌源：土壤采自新疆克拉玛依油田附近离地表15~20cm被磺化钻井液伤害的土壤，多点采样后装入无菌袋密封保存备用，样品取回后在实验室4℃下保存。
磺化混合液实验配方：2%褐煤树脂(SPNH)+2%磺甲基酚醛树脂(SMP)+0.5%复合离子大分子聚合物(FA-367)，由大方集团重庆分公司提供。
无机盐培养基：0.3%NaNO3+0.1%K2HPO4+0.05%KCl+0.05%MgSO4·7H2O+0.0002%CaCl2+0.0001%FeSO4+蒸馏水，pH值7.0~7.2。
磺化钻井液富集驯化液体培养基：无机盐培养基+0.2%的磺化混合液。
分离培养基：磺化钻井液富集驯化筛选降解培养基+1.8%琼脂。
细菌富集培养基：0.5%牛肉膏+1%蛋白胨+0.5%NaCl，pH值7.0~7.2。
细菌斜面培养基：细菌富集培养基+1.8%琼脂。以上培养基所用试剂均为分析纯。
HH-4恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司;TE3102S电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;HVE-50高压灭菌器，华粤企业集团有限公司;HFsafe-l200超净工作台，上海力申科学仪器有限公司;SPx-250生化培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂;ChemStarATS-03M2数控恒温摇床，上海堪鑫仪器设备有限公司;正置显微镜BX63+DP73，奥林巴斯;1.5mL离心管，泰州市诚宝医疗器械有限公司;小型台式高速冷冻离心机，德国艾本德公司;BIO-RADMycyclerPCR仪、BIO-RADPOWERPAC200电泳仪、BIO-RADGelDocXR+凝胶成像系统，美国Bi0-Rad(伯乐)公司;DR1010COD测定仪(配套消解管)，上海世录仪器有限公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株的驯化、分离 称取10g样品，加入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，摇床振荡30min，打散钻井液后静置5min，取上清液作为菌源。将菌液加入到磺化钻井液富集驯化培养基，温度设为35℃，转速为150r/min，恒温培养7d，此为1个周期。1个周期结束后取10mL培养液，加入到新鲜的磺化钻井液培养基中培养7d，驯化时磺化钻井液的质量分数按0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%递增，共5个周期。驯化结束后将培养液稀释到适当的质量分数，取0.2mL菌液涂布于分离培养基中，置于恒温培养箱，在35℃培养3d，根据菌落的大小、形状、透明度、颜色、隆起程度等特征，对各个平板中长出的单个菌落进行初步筛选。将形态不同的菌落进行划线分离纯化，直至无杂菌生长。将所得的单菌株接到细菌斜面培养基上，28~35℃培养2d后于4℃冷藏保存。
1.2.2 菌株的分子生物学鉴定 根据菌株生理生化和分子生物学鉴定菌株[15]，对其进行分类。DNA提取：用无菌牙签挑取少量菌体，置于1.5mL离心管中，加入30μL去离子水，震荡使菌体分散，盖紧离心管，置于微波炉中火加热2min，加热后立即将离心管冰浴2min，然后将离心管放入离心机，12000r/min离心1min，吸取离心管液体上清液置于-20℃备用。以提取的目的DNA为模板，使用通用引物(27F和1492R)进行扩增，PCR反应体系为50μL：2×TaqPCRMasterMix25μL，引物27F/1492R(10μmol/L)各2μL，目的DNA为3μL，ddH2O为18μL。PCR反应程序为：模板DNA94℃预变性4min，模板DNA94℃变性1min，模板DNA与引物55℃退火1min，引物72℃延伸90s，30个循环，产物72℃延伸10min得到PCR产物。PCR产物经电泳检测后，交至武汉生工测序公司测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析，并通过MEGA5.0构建系统发育树。
1.2.3 菌株的降解特性研究
(1)单因素试验。
①pH值对菌株生长量的影响。
将富集后的菌株接种于磺化钻井液富集驯化液体培养基，接种量为10%，pH值依次调为7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0，在35℃、150r/min[15]条件下培养7d，以菌落形成单位(CFU指单位体积中的活菌个数。cfu/mL指的是每毫升样品中含有的细菌菌落总数，下同)方式来确定菌株的最佳生长pH值。
②盐质量分数对菌株生长量的影响。
将富集后的菌株接种于磺化钻井液富集驯化液体培养基，接种量为10%，NaCl添加量依次为：3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，在35℃，150r/min条件下培养7d，以菌落形成单位方式来确定菌株的最佳生长盐质量分数。
③摇床转速对菌株生长量的影响。
将富集后的菌株接种于磺化钻井液富集驯化液体培养基，接种量为10%，转速依次调为90、120、150、180、210、240r/min，35℃培养7d，以菌落形成单位方式来确定菌株的最佳生长转速。
④温度对菌株生长量的影响。
将富集后的菌株接种于磺化钻井液富集驯化液体培养基，接种量为10%，温度依次设为25、30、35、40、45、50℃，培养7d，以菌落形成单位方式来确定菌株生长的最适温度。
⑤接种量对菌株生长量的影响。
将富集后的菌株接种于磺化钻井液富集驯化液体培养基，接种量依次为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，在恒温振荡培养器中培养7d，以菌落形成单位方式来确定菌株生长的最适接种量。
⑥N源对菌株生长量的影响。
将富集后的菌株接种于磺化钻井液富集驯化液体培养基，N源依次为NaNO3、(NH4)2NO3、NH4Cl、蛋白胨、牛肉膏，在恒温振荡培养器中振荡培养7d，以菌落形成单位方式来确定菌株生长的最适N源。
⑦P源对复筛菌株生长的影响。
将富集后的菌株接种于磺化钻井液富集驯化液体培养基，P源依次为K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4，在恒温振荡培养器中振荡培养7d，以菌落形成单位方式来确定菌株生长的最适P源。
(2)正交试验。根据单因素试验结果，确定菌株接种量10%、P源为K2HPO4、N源为蛋白胨的条件下，选取pH值、盐质量分数、转速和温度进行正交试验。在最佳培养条件下，测定菌株生物量及化学需氧量(简称COD，指水样在一定条件下，以氧化1L水样中还原性物质所消耗的氧化剂的量为指标，折算成每升水样全部被氧化后，需要的氧的毫克数，以mg/L表示)的降解率。
(3)验证试验。在正交最佳条件下培养7d，测Xh8对磺化钻井液COD降解效率。
1.2.4 磺化钻井液COD降解率的测定 挑取一环分离纯化后获得的菌株，接种到细菌富集培养基中，取生长对数期的菌液，以10%的接种量接入到磺化钻井液富集驯化液体培养基中，在35℃、pH值9、150r/min恒温摇床震荡培养7d，测定COD降解率。磺化钻井液COD降解率用DR1010COD测定仪测定。将待检测液稀释10倍混匀，然后用移液管吸取2mL样品加入消解管中，拧紧小瓶盖，轻轻上下颠倒几次使其混合均匀，采用同样的方法用等量去离子水作为空白，以未接种的磺化钻井液富集驯化液体培养基为对照。再将消解管插入预先加热的DR1010反应器中，关上反应器盖子加热2h。反应完成后，待消解管冷却至120℃以下，取出消解管并轻轻晃动几次，待消解管冷却至室温后，将空白消解管插入DR1010COD测定仪中归零，再插入其他待测定的消解管读取数值
式中，C为COD降解率，%;D0为对照组磺化钻井液富集驯化液体培养基中COD的质量浓度，mg/L;Dx为接菌组磺化钻井液富集驯化液体培养基中COD的质量浓度，mg/L。
2 实验结果与讨论
2.1 菌株分离筛选结果
经过富集、驯化、分离，从新疆克拉玛依油田被磺化钻井液伤害的土壤中分离得到1株具有较好的降解磺化钻井液效果的菌株，通过形态、生理生化及分子生物学鉴定命为Xh8(Bacillusflexus)，菌落形态、菌体镜检及系统发育树结果见图1，GenBank登录号为MK012676。
2.2 降解特性研究
2.2.1 单因素试验
(1)Xh8生长最适pH值实验。从图2可知，Xh8的最宜生长pH值为9.5。当pH值为7.5~9.5时，菌株的生长量随着pH值的增加而增大，但当pH值大于9.5以后，Xh8菌株生长量急剧下降，说明pH值会影响微生物体内酶的活性，使酶活性中心的某些基团和底物的解离程度发生改变，酶对底物的结合能力也随之发生改变，从而影响酶对底物的催化能力。
(2)Xh8生长最适盐质量分数实验。从图3可知，Xh8最高耐受盐质量分数达4%。当盐质量分数大于4%以后，菌株生长量急剧下降，说明在盐质量分数较低情况下，其分子量较小，容易被生物吸收利用，但在盐质量分数较高的条件下，会严重地抑制生物的繁殖生长。
(3)Xh8生长最适摇床转速实验。由图4可知，Xh8的最宜生长转速为150r/min。由于摇床转速的增加，使得降解体系中氧气的溶解速度增加，在好氧气培养过程中，有利于微生物的生长繁殖。但从图4发现，当转速超过150r/min时，菌株的生长量慢慢地降低，说明转速过高时细菌表面与液体和试管的剪切力会增大，对细菌胞体有一定的损伤，对细菌的生长不利，因而使得菌体的生长量降低。
(4)Xh8生长最适温度实验。由图5可知，Xh8的最宜生长温度为35℃。在温度较低时，微生物的生长量随温度的提高而增加，但温度超过35℃以后，微生物的生长量迅速下降，说明高温会影响微生物体内酶的活性，并且当温度较高时，可能会造成酶不可逆的变性，致使微生物体内酶失活，微生物发生热致死的现象。
(5)Xh8生长最适接种量实验。由图6可知，Xh8的最宜生长接种量为10%。当接种量超过10%时，Xh8菌株的生长量呈下降趋势。这是因为初始接种量过大，微生物的个数多，对底物消耗快，微生物大量繁殖后底物质量分数不能维持菌株生长所需的质量分数，造成新的菌株生长繁殖受影响;另一方面过量的接种量使得培养基的黏度增加，试管内的溶氧量降低，供氧不足使得试管内好氧菌种的代谢能力降低，生长繁殖受阻。
(6)Xh8生长最适N源实验。由图7可知，Xh8的最宜生长N源为蛋白胨。蛋白胨营养物质丰富，既含有机氮化合物，又有一些维生素和糖类可供微生物利用，因而Xh8菌株生物量较高。氮是构成生物体的必需元素，因此N源是影响磺化钻井液降解菌生长和磺化钻井液降解菌降解性能的重要营养物质。
(7)Xh8生长最适P源实验。由图8可知，Xh8的最宜生长P源为K2HPO4。不同种类的磷酸盐微生物生长快慢也不同，说明磷也是微生物生长的必需元素，因而P源也是影响磺化钻井液降解菌生长和磺化钻井液降解菌降解性能的重要营养物质。
2.2.2 正交试验Xh8菌株正交试验结果见表1。pH值的极差R最大，是影响Xh8降解磺化钻井液COD降解率的关键因子，其次是盐质量分数和温度，而转速影响最小。因此Xh8降解磺化钻井液COD最适培养条件为：pH值9.5、盐质量分数4.5%、转速150r/min、温度35℃。
2.2.3 验证试验Xh8菌株在正交试验降解COD最适条件下培养7d，磺化钻井液COD降解率22.9%。
3 结论
(1)获得了1株降解磺化钻井液的芽孢杆菌，命名为弯曲芽孢杆菌Xh8。单因素试验结果显示：磺化钻井液降解菌Xh8的生长最适条件：pH值为9.5、质量分数为4%、转速为150r/min、温度为35℃，接种量为10%、N源为蛋白胨、P源为K2HPO4。正交试验结果表明：磺化钻井液降解菌Xh8的最佳降解条件：pH值为9.5、盐质量分数为4.5%、转速为150r/min、温度为35℃、接种量为10%，7d降解率为22.9%。pH的R极差最大，是影响Xh8菌株COD降解的关键因子，其次为盐质量分数、温度、转速。
(2)该磺化钻井液降解菌株降解性能实验虽证实了菌株可降解多种物质，但菌株对磺化钻井液COD降解能力大小有一定不足，这是降解菌应用到伤害治理中的障碍。关于Xh8菌株对磺化钻井液降解特性的研究，仅测定了1个周期7d的降解率22.9%，随着降解时间的延长，降解效率会提高。建议下一步进行混合菌剂构建与土壤修复试验研究。
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